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Team:Chiba/notebook/input/august
From 2008.igem.org
８月の実験ログ
Contents |
2008.8.20
- BBa_J22136(2007)①
- BBa_J22136(2008)②
- BBa_J22141(2007)③
- BBa_J22141(2008)④
- BBa_E0612(2008)⑤
| Sample No. | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
| DNA tamplate | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
| FW primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| VR primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| dNTPmix | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| thermo pol buffer | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| DNA pol(VENT) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| dH2O | 68 | 68 | 68 | 68 | 68 |
| TOTAL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
-->Gel Check
| Sample No. | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
| Sample DNA | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
| loading dye | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| dH2O | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Total | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
-->どれもバンド出ず。
- BBa_R0051(2007)
- BBa_R0051(2006)
- BBa_J06650(2007)
- BBa_J06650(2006)
- BBa_J22136(2007)
- BBa_J22141(2007)
-->BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(１個のみ)
2008.8.21
8.20にtransformationしたもの
- BBa_R0051(2007)
- BBa_R0051(2006)
- BBa_J06650(2007)
- BBa_J06650(2006)
- BBa_J22136(2007)
- BBa_J22141(2007)
を２ml培養、12h。ただしコロニーが１個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 さらに1h培養した。
UV照射実験(プレート編)(~24日)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて、試験管で2ml培養。(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類。
37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを105希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く。
37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm。
UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする。
両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する。
37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに105希釈して20μl撒いた。
コロニー数
| AHLなし | AHL100nM | |
| 9h | 606 | 453 |
| 12h | 146 | 151 |
AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた。→機能チェックはOK
2008.8.22
2ml培養した
- BBa_R0051(2007)
- BBa_R0051(2006)
- BBa_J06650(2007)
- BBa_J06650(2006)
- BBa_J22136(2007)
- BBa_J22141(2007)
をミニプレした。
insert check:Digestion
- BBa_J06650(2006)
- BBa_J06650(2007)
- BBa_J22136(2007)
- BBa_J22141(2007)
- BBa_R0051(2006)
- BBa_R0051(2007)
BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。
混ぜ表
| double | simgle | |
| dH2O | 14 | 25 |
| 10×BSA | 7 | 10 |
| 10×NE | 7 | 10 |
| EcoRI | 3.5 | 5 |
| PstI | 3.5 | - |
UV照射実験(液体編)(~24)
-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用。
グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)
37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する。UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm。
UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ105希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた。
37℃で12h培養した後のコロニー数
| AHLなし | AHL100nM | |
| 15min | 136 | 0? |
| 4h | 40 | 31 |
| 8h | 10 | 0 |
| 12h | 0 | 0 |
いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった。
2008.8.25
BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり
プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。
| OD=0.495培養液 | 0.67μl |
| 60%グリセロール | 0.33μl |
| 20%グリセロールストック(計) | 1.00ml |
2008.8.28
BBa_I7106(2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してMini prep(60mlで溶出):
-->Digestion
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 2 |
| 10×BSA | 1 |
| 10×NE | 1 |
| EcoRI | 0.5 |
| PstI | 0.5 |
| DNA | 5 |
| TOTAL | 10 |
Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl
PCR
RBS＋CI
混ぜ表
| DNA | 1 |
| FW primer | 2.5 |
| VR primer | 2.5 |
| dNTPmix | 5 |
| thermo pol buffer | 5 |
| DNA pol(VENT) | 1 |
| dH2O | 34 |
| TOTAL | 50 |
| PCR産物 | 1 |
| Dye | 1 |
| dH2O | 4 |
| TOTAL | 6 |
-->濃度は33.6ng/μg
| DNA | 1 |
| FW primer | 5 |
| VR primer | 5 |
| dNTPmix | 10 |
| thermo pol buffer | 10 |
| DNA pol(VENT) | 1 |
| dH2O | 68 |
| TOTAL | 100 |
| PCR産物 | 1 |
| Dye | 1 |
| dH2O | 4 |
| TOTAL | 6 |
-->バンド出ず。
2008.8.30
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 6 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| XbaI | 2 |
| DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
| TOTAL | 60 |
-->30μlゲル抽出
-->ゲル抽出
-->Zymo Clean
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック-->OK,4μlはLigation用
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 4 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| SpeI | 4 |
| DNA | 75ng/μl×30μl(2μg) |
| TOTAL | 60 |
-->30μlゲル抽出
-->Zymo Clean
-->SAP
混ぜ表
| dH2O | 9 |
| DNA | 10 |
| SAP | 1 |
| SAP Buffer | 10 |
| TOTAL | 30 |
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック
-->OK,4μlはLigation用
混ぜ表
| - | b.g | |
| dH2O | 1.4 | 8 |
| Ligase | 1 | 1 |
| Ligase Buffer | 2 | 2 |
| Vector | 1.8 | 1 |
| Insert | 3 | - |
| TOTAL | 10 | 10 |
-->Transformation(XL10G)
-->CFU40(b.gは22)
コロニーPCR(16コつつく):PCR
混ぜ表
| VF | 2 |
| VFR | 2 |
| dNTP | 2 |
| thermo pol buffer | 2 |
| Tag | 0.3 |
| dH2O | 11.7 |
| TOTAL | 20 |
-->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
-->Mini prep
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 6 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| XbaI | 2 |
| DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
| TOTAL | 60 |
混ぜ表
| Digestion産物 | 30 |
| Dye | 6 |
| TOTAL | 36 |
-->Zymo Clean
-->NFW5μlで溶出
-->Gel Check
混ぜ表
| dH2O | 4 |
| DNA | 1 |
| Dye | 1 |
| TOTAL | 6 |
-->Gel Check-->OK
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 4 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| SpeI | 4 |
| DNA | 75ng/μl×30μl(2.25μg) |
| TOTAL | 60 |
混ぜ表
| Digestion産物 | 30 |
| Dye | 6 |
| TOTAL | 36 |
-->Zymo Clean
-->NFW10μlで溶出
-->SAP
混ぜ表
| dH2O | 9 |
| DNA | 10 |
| SAP | 1 |
| SAP Buffer(×10) | 10 |
| TOTAL | 30 |
-->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
-->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX -->Zymo Clean
-->NFW5μlで抽出
混ぜ表
| dH2O | 4 |
| DNA | 1 |
| Dye | 1 |
| TOTAL | 6 |
-->ゲルチェックOK
混ぜ表
| - | b.g | |
| dH2O | 1.4 | 8 |
| Ligase | 1 | 1 |
| Ligase Buffer | 2 | 2 |
| Vector | 1.8 | 1 |
| Insert | 3 | - |
| TOTAL | 10 | 10 |
-->25℃で2h放置 -->Transformation(XL10G):
-->CFU40(b.gは22)
