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８月の実験ログ

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2008.8.20
PCR
 * BBa_J22136(2007)①
 * BBa_J22136(2008)②
 * BBa_J22141(2007)③
 * BBa_J22141(2008)④
 * BBa_E0612(2008)⑤

-->Gel Check

-->どれもバンド出ず.

Transformation


 * BBa_R0051(2007)
 * BBa_R0051(2006)
 * BBa_J06650(2007)
 * BBa_J06650(2006)
 * BBa_J22136(2007)
 * BBa_J22141(2007)

-->BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった. (１個のみ)

2008.8.21
8.20にtransformationしたもの


 * BBa_R0051(2007)
 * BBa_R0051(2006)
 * BBa_J06650(2007)
 * BBa_J06650(2006)
 * BBa_J22136(2007)
 * BBa_J22141(2007)

を２ml培養、12h. ただしコロニーが１個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 さらに1h培養した.

UV照射実験(プレート編)(~24日) -Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用. グリストをつついて、試験管で2ml培養. (LB-Amp,Cm)(LB-Amp,Cm,AHL100nM)の2種類. 37℃で12h培養後、濁ったらそれぞれを105希釈してAHLが入っていないものはLB-Amp,Cm,AHLが入っているものはAHL-Amp,Cm,AHL100nMのプレートにそれぞれ20μl撒く. 37℃で12h培養後、きちんとコロニーができていることを確認し、両方のプレートにUVを照射する. UVの波長は254nm,UVランプとプレートの距離は14cm. UVを照射して9h後、21h後にそれぞれ両方のプレートに次の同じ操作をする. 両方のプレートのコロニーをつついてそれぞれ(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)2ml培養する. 37℃,で12h培養後、濁っていたので、それぞれを(LB-Amp,Cm),(LB-Amp,Cm,AHL100nM)のプレートに105希釈して20μl撒いた.

コロニー数

AHLが入っていないほうのコロニーはいづれも光っていた. →機能チェックはOK

2008.8.22
Mini prep

2ml培養した
 * BBa_R0051(2007)
 * BBa_R0051(2006)
 * BBa_J06650(2007)
 * BBa_J06650(2006)
 * BBa_J22136(2007)
 * BBa_J22141(2007)

をミニプレした.

insert check:Digestion


 * BBa_J06650(2006)
 * BBa_J06650(2007)
 * BBa_J22136(2007)
 * BBa_J22141(2007)
 * BBa_R0051(2006)
 * BBa_R0051(2007)

BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方.  混ぜ表

UV照射実験(液体編)(~24) -Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-(BW)の2plasmidを使用. グリストをつついて2ml培養×2(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM) 37℃で、12h培養後、濁ったらそのまま小さなプレートにLB培地ごと移してUVを照射する. UVの波長は254nm,UVランプまでの距離は8cm. UVを照射して、15min,4h,8h,12h,たったら、両方のプレートからLB培地ごと20μlずつ採取しそれぞれ105希釈し、そこから20μlをそれぞれ(LB-Amp,Cm)(LB-Amp,cm,AHL100nM)のプレートに撒いた.

37℃で12h培養した後のコロニー数  いづれのプレートもAHLが入っていないものはGFPが確認できたが、AHL100nMのものは確認できなかった.

2008.8.25
BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h) 培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした. 

2008.8.28
Transformation

BBa_I7106(2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してMini prep(60mlで溶出):

-->Digestion 混ぜ表 Digestion 37℃、30分 プラスミドの濃度は33.6ng/μl

PCR <BR>RBS＋CI <BR>混ぜ表

ゲルチェック

-->濃度は33.6ng/μg

ベクターのPCR BBa_I7106 混ぜ表

ゲルチェック

-->バンド出ず.

2008.8.30
Digestion

x-RBS-cI-s-p(780bp)

混ぜ表 -->30μlゲル抽出

-->ゲル抽出

-->Zymo Clean

5μ抽出,うち1μlをゲルチェック-->OK,4μlはLigation用

Digestion

-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)

混ぜ表 -->30μlゲル抽出

ゲル抽出

-->Zymo Clean

-->SAP

混ぜ表 5μ抽出,うち1μlをゲルチェック

-->OK,4μlはLigation用

Ligation

混ぜ表

-->Transformation(XL10G)

-->CFU40(b.gは22)

コロニーPCR(16コつつく):PCR

混ぜ表 -->Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現. そのコロニーを2ml培養し、mini prepした.

-->Mini prep

Digestion

x-RBS-cI-s-p(780bp)

混ぜ表

Gel Extract

混ぜ表

-->Zymo Clean

-->NFW5μlで溶出

-->Gel Check

混ぜ表 -->Gel Check-->OK

Digestion

-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)

混ぜ表

Gel Extract

混ぜ表

-->Zymo Clean

-->NFW10μlで溶出

-->SAP

混ぜ表 -->37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,

-->Binding Bufferを90μl加え、VORTEX -->Zymo Clean

-->NFW5μlで抽出

Gel Check

混ぜ表 -->ゲルチェックOK

Ligation

混ぜ表 -->25℃で2h放置 -->Transformation(XL10G):

-->CFU40(b.gは22)