Team:Chiba/notebook/input/september

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2008.9.1

 * Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック.
 * -Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック.
 * -Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
 * 結果-->GFPが発現していた. -->-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
 * ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる.
 * -Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check

混ぜ表

UV照射テスト
 * -Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
 * グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
 * 37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
 * 小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始. (UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく. )
 * 乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした.
 * UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取. それぞれを
 * 104,105希釈し、20μlをプレートに撒いた.
 * 37℃,12h後にコロニーを数える.

コロニー数

2008.9.2
UV照射実験
 * Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
 * 37℃,12h後,ODを測定して102~103のコロニーができるようにプレートに撒く. Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
 * 新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる.
 * PrecA-RFPのプレートにUVを照射する. UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する. Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく.
 * UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた.
 * それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る.


 * 結果


 * PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった.

2008.9.12

 * Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト

I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養.

37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた.

L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた.

混ぜ表

L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した.

結果は以下のとおり.

2008.9.13
Time Delay Test ①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)

②Plac-RhlI -Amp(BW)

③Plac-LasI -Amp(BW)

④Ptet-LuxI -Amp(BW)

①LB-Kan 2ml培養
 * プレ培

②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養

④LB-Amp　2ml培養

↓over night


 * 本培

50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える.

50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える.

50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える.

OD>2となったらWash


 * ①に関して

①

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる

LB-Kanを20ml加える.


 * ②③④に関して

②、③、④

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる.

LBを2ml加える.


 * ↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる.

LBを2ml加える.


 * ↓冷却遠心(3700rom,3min)

上澄み捨てる.

LB-Ampを6ml加える.

48欠Deep Well