Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma/j

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Sigma Miniprep kit によるDNA精製プロトコル

 * 1) スピンダウンしたペレットに、Resuspension Solution（冷蔵庫に保管）を200μL入れてボルテックスで懸濁
 * 2) Lysis Bufferを200μL加え、４～６回チューブを転倒させる. この操作で菌の細胞膜を溶かしている. この時DNAが壊れてしまう可能性があるので優しく取り扱うこと.
 * 3) Neutralization Bufferを350μL加え、すぐにチューブを４～６回転倒させて完全に混ぜる. 中和による沈殿が固まってしまうのを防ぐため、このBufferを加えたら溶液をすばやく優しくまぜる.
 * 4) 10分間、遠心機で13,000rpm設定で遠心. 白い塊状のペレット（菌の死骸）が形成する. このとき同時にカラムの洗浄を行ってしまうのが良い. Colum Solution 500μLを蓋ナシのチューブに入れたカラムに加えて、1分間遠心（13,000rpm）. １分間とあるが、洗浄操作なので10分やっても大丈夫らしい. 遠心を終えたカラムは水気を取っておくこと.
 * 5) 4の上澄み液を直接、またはピペッティングによりさきほど洗浄したカラムに入れる.
 * 6) 1分間遠心（13,000rpm）してカラムにDNAをつける.
 * 7) カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける.
 * 8) Optional Bufferを500μL入れて1分間遠心（13,000rpm）. シリカを洗う. またWash系のBufferは粘性が低くとびやすいので、ピペットマンの操作には十分気をつけること.
 * 9) カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける.
 * 10) Wash Bufferを500μL入れて1分間遠心（13,000rpm）. カラムをこの操作で洗浄する.
 * 11) 9～10の操作を繰り返す.
 * 12) 残っているWash Bufferを除去するためにさらに2～3分間空遠心（13,000rpm）. Buffer中のEtha-OHが残っていると後に続く酵素反応が阻害されてしまうため.
 * 13) カラムを新しい1.5μLのマイクロ遠心チューブにセットする. この時、Etha-OHをとばすために少しだけ時間をおくとよい.
 * 14) Elution Bufferを100μL（個人的に50μLがちょうどいいので50μLでの抽出を勧める. ）を各カラムの中央に敵かし１分間静置. （もっと長時間でも良い）ここでカラムからDNAの溶出を行う.
 * 15) 1分間遠心（13,000rpm）し、溶液を新しいチューブに移し変えて蓋を閉めたらミニプレ完了！

井山

コメント（冨永）
 * 溶出操作で，50ulとするとDNAを一部損失します. 高濃度のDNA溶液が必要な場合，培養液を5 mlくらい用意して，100 ulで溶出するといいと思います.