Team:Chiba/Project/Experiments:Crosstalk



Design


Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration(2).This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.

異なる生物はそれぞれに異なるLuxIタイプのタンパク質を持ち、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する. それぞれの生物種のLuxIタイプのタンパク質、それが合成する分子名は以下の表のようである. (Fig.4).AHLを受け取り応答するLuxRタンパク質はVibrio fischeri由来であり、3OC6HSLに応答する. しかし、他種生物由来のAHLにも応答することが知られており、このとき、より高い濃度のAHLが必要となる(1),(2).AHLがゆっくり溜まっていく時、LuxRは3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する. (冨永)



Experiments
センダーの違いによるディレイをみることをめざし，次の表に示すセンダーとレシーバを別々の培地で培養@37℃,12h後（stationaryに達したら？対数増殖機の細胞の分裂によるsender量増加を防ぐため？），それぞれを混ぜ，３０℃で培養し，一定時間ごとの蛍光強度（__nm）を測定した.

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

 * 37°Cで行った実験と比べ、LasIが活性. （８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245）
 * LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた.
 * Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった.
 * また、差が一番でたのが30°Cで行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456.

Results&Discussion
3OC6HSL,3OC12HSLに対する、LuxRの応答時間に、二時間の差ができた（3OC12HSLの場合、3OC6HSLに比べて二時間遅れて応答する）. (そのときの条件は、培養温度30°C、genelatorの株はXL10Gold,Receiverの株はJW1908のとき、であった. ) <??

Method
1.Crosstalk test

To characterize quorum sensing crosstalk, constitutive AHL senders were mixed with constitutive receivers and measure fluorescence intensity.
 * 1) Transformed Senders into E.coli strains(XL10GOLD) and Receiver into E.coli strain(JW1908).
 * 2) Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h
 * 3) Mixed them.
 * 4) Incubated at 30°C.
 * 5) Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.

more details...

Other Experiments
目視実験 --Masahiro 07:16, 29 October 2008 (UTC)
 * 試験管内の培養液(2mL)が、緑色を呈しているときの蛍光強度：150～200.

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

 * CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない.
 * RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする.
 * Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった.

Senders(JW1908),T9002(JW1908)@30°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

 * 特に37°Cで行ったときと差はない
 * BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった.
 * 次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う.

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@37°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

 * SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた.
 * この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい.
 * （８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）

Senders(XL10Gold),T9002(JW1908)@25°C菌数(μL)、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う. ）
 * どのSenderもGFP強度20～50の範囲. ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず.