Team:Chiba/Study

From 2008.igem.org

(Difference between revisions)
Line 8: Line 8:
|}
|}
-
=='''難代謝性分子'''==
+
=='''勉強会'''==
-
リプレッサーとして今上がっているのが以下のとおり。
+
-
これら以外にもどのような難代謝性分子やレギュレーター、そして分子の生産方法についても調べていきます。
+
::今までの勉強会についての簡単なログです。
-
 
+
===4/09/08 第1回iGEM勉強会===
-
*DmpR : (methyl)phenol
+
*「iGEMとはなにか?」
-
*PcaR : p-hydroxy benzoate
+
*プレ事前研究
-
*CatR : cis,cis-macomater
+
===4/11/08 第2回iGEM勉強会===
-
*PrmR : n-alkane
+
*「細胞、微生物学・細胞ロボットとは?」
-
*XylR : nitrotoluene
+
===4/14/08 第3回iGEM勉強会===
-
::Toluene
+
*「セントラルドグマとは?」
-
*AreR : Benzyl alkanoate
+
===4/17/08 第4回iGEM勉強会===
-
*BenR : Bezoate
+
*「転写制御:Lacオペロンとは?」
-
*SalR : Salicylate Esters
+
===4/18/08 第1回事例研究===
-
 
+
【事例研究担当】
-
 
+
===4/22/08 第2回事例研究===
-
 
+
*2年生、実際に大腸菌を見せてもらう。
-
 
+
【事例研究担当】
-
*調べたこと
+
*川崎 imperial 2007
-
:*phnolの溶解度8.3 g/100 ml(20℃)[http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol [1]]
+
===4/25/08 第5回勉強会&第3回事例研究===
-
:*tyrosineからphenolを合成する反応[http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?rn:R00728 [R00728]]
+
*「biobrickと遺伝子回路」
-
:*tyrosineからphenolを合成する酵素:TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)[http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?enzyme+4.1.99.2 EC 4.1.99.2 ]
+
===4/28/08 第4回事例研究===
-
:*TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)の原典
+
【事例研究担当】
-
::*Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Purification Crystallization,and Properties :''Biol.Chem''.,'''245''',No.7,1767-1772,1970
+
*久保 Penn state 2006
-
:::TPL(''Escherichia intermedia'' A-21由来)の特性について.以下の項目について説明があります。
+
*杉山 Mississippi 2006
-
:::*stability
+
===5/01/08 第5回事例研究===
-
:::*stoichiometry
+
【事例研究担当】
-
:::*sedimentation coefficient(20℃,water)= 7.77
+
*冨永 Peking 2007
-
:::*diffusion coefficient(20℃,water)=4.42×10<sup>-7</sup>cm<sup>2</sup>/sec
+
*小林 Rice 2007
-
:::*Michaelis constant = 2.31×10<sup>-4</sup> M (基質はL-tyrosine)
+
===5/02/08 第6回事例研究===
-
:::*inhibitor(L-alanine)  K<sub>i</sub>=6.53×10<sup>-3</sup> M
+
【事例研究担当】
-
:::*inhibitor(phenol)    K<sub>i</sub>=3.56×10<sup>-5</sup> M
+
*福冨 MIT 2007
-
:::・・・他
+
*井山 Toront 2007
-
 
+
===5/03/08 第7回事例研究===
-
::*Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Coefector Requirements:''Biol.Chem''.,'''245''',No.7,1773-1777,1970
+
【事例研究担当】
-
:::TPLはピリドキサルリン酸(PLPA)がないと不活性である。また、最大活性を示すには、K<sup>+</sup>およびNH<sub>4</sub><sup>+</sup>が必要。Na<sup>+</sup>により不活性化。など、TPLの機構についての説明があります。
+
*川崎 Berkley 2006
-
:*Nick J. P. Wierckx,* Hendrik Ballerstedt, Jan A. M. de Bont, and Jan Wery.Engineering of Solvent-Tolerant Pseudomonas putide S12 for Bioproduction of Phenol from Glucose:''Appl. Environ. Microbiol.'','''71''',No.12,8221-8227,2005
+
===5/30/08 Wiki講習会===
-
::グルコースからチロシン経由でpseudomonas putide S12で25時間後にフェノールを1.5mM生成。オクタノールの媒質二相で100時間後にフェノールを58mM生成
+
*[http://ja.wikipedia.org/wiki/Wikipedia:%E7%B7%A8%E9%9B%86%E3%81%AE%E4%BB%95%E6%96%B9#.E7.94.BB.E5.83.8F.E3.83.BB.E9.9F.B3.E5.A3.B0.E3.83.BB.E5.8B.95.E7.94.BB wikipedia-Wikiの編集の仕方]
-
:*tyrosine biosynthesis pathway [http://www.kegg.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=ppu&mapno=00400 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis - Pseudomonas putida KT2440]
+
*[[Team:Chiba|英語版Chibaメインページ]]
-
::*論文とは違う株です。
+
===6/7/08 第1回ポスター発表===
-
:*Milic Dalibor; Matkovic-Calogovic Dubravka; Demidkina Tatyana V; Kulikova Vitalia V; Sinitzina Nina I; Antson Alfred A.Structures of apo- and holo-tyrosine phenol-lyase reveal a catalytically critical closed conformation and suggest a mechanism for activation by K+ ions.''Biochemistry'','''45''',7544-7552,2006
+
*Project 1 仇討ち大腸菌   冨永将大/小林あおい
-
::TPLの触媒作用に重要なコンホメーションについて、およびフェノール生成反応のメカニズムについての記述があります。、
+
*Project 2 Memory Protector   福冨浩樹/杉山まい
-
:*Gibson, J.M.,P. S. Thomas, J. D.Thomas, J. L. Baker, S. S. Chandran, M. K. Harrup, K. M. Draths, and J. W. Frost.Benzene-Free Synthesis of Phenol.''Angew.Chem.Int.Engle''.'''40''',1945-1948
+
*Project 3 Electro Bio Graphics  久保喬義
-
::フェノールをシキミ酸から合成。
+
*Project 4 Etch o sketi  川崎浩平
 +
*Project 5 The Integral E.coil   井山佳美
 +
*Project 6 Invisible Picture  香取崇広
 +
===6/26/08 第6回勉強会===
 +
*「蛍光タンパク」
 +
===6/28/08 メール勉強会===
 +
*「色素について」
 +
:色素となる蛋白にはどのようなものがあるのか(大腸菌の出すことができる色素はどのようなものがあるか。)
 +
:大腸菌の色素合成システム
-
=='''企画のための予備知識調べ'''==
+
==ルーキーのための勉強会==
 +
===勉強会責任者===
 +
*第1回 責任者:川崎浩平  使用テキスト「30 DNAの転写」
 +
*第2回 責任者:香取崇広  使用テキスト「31 転写調節」←アテニュエーターの部分は削除
 +
*第3回 責任者:杉山まい  使用テキスト「33 タンパク質の生合成」
 +
*第4回 責任者:井山佳美  使用テキスト「現代化学 P.57 Fig.2  P.58 Fig.3」
 +
*第5回 責任者:久保喬義  使用テキスト「現代化学 P.58 Fig.4  P59 Fig.5」
 +
 +
===日程===
 +
場所:1号棟3階ゼミ室
 +
*第1回 5/1(木)
 +
*第2回  5/2(金)
 +
*(できれば5/5(祝)もやります)
 +
*第3回  5/8(木)
 +
*第4回  5/9(金)
 +
*第5回  5/12(月)
 +
 +
===進度について===
 +
:毎回の勉強会で理解できない人が出た場合、次の勉強会でもまた同じ内容について学びます。全員が理解した状態で初めて次に進めます。また梅野先生の研究室のそばで学ぶので、不明な点が出た場合はすぐに聞きにいきましょう。その場合はわからないところを紙に書き出して、いっぺんに聞きに行くこと。
 +
 +
===テキストについて===
 +
:当初予定にあった「RNAプロセシング」や「エネルギー代謝(この系列のプリントはいらないらしい)」については学ぶ必要がなく、上記にあげた資料のみ理解できれば十分だそうです。できるだけ少ないテキストで勉強し、短時間で戦えるようになりたいので、これ以上資料は増やしません。何か足りない場合は梅野先生が随時資料を提供してくれるそうです。
 +
 +
===責任者について===
 +
:各回の進行役は責任者が行います。
 +
責任者は予習をする際、他のテキストを使用してもかまいませんが、必ずその項目と同じような表記の部分だけを読み物程度に参考にするようにしてください。
 +
::例)「DNAの転写」なら他のテキストでも「DNAの転写」の部分だけを参考にする。
 +
 +
:また責任者が間違っているのに気づかず進んでしまうことを防ぐためにもサブリーダーを各回1~2人おくことにします。サブリーダーも責任者と同様、同じ項目について皆に説明出来るよう予習をしてきます。ただし予習の段階で責任者とは一緒に勉強をしないでください。
 +
:とりあえず、第1回目のサブリーダーは香取君。 2回目は久保君が引き受けてくれました。(と思っています)
 +
また3年生の小林さんがサブリーダーとして、可能な範囲内で参加してくださるそうです。
-
=== ①バイオブリックパーツを挙げる :福富、杉山===
 
-
'''Sender signal''' [[Image:Chiba-signalling.png]]
+
==調べものノート==
 +
==='''7/1/08調べ学習'''===
 +
==== ①バイオブリックパーツを挙げる :福冨浩樹、杉山まい====
 +
=====Sender signal=====
 +
[[Image:Chiba-signalling.png]]
*BBa_F1610(available,works)  
*BBa_F1610(available,works)  
3OC6HSL Sender device  
3OC6HSL Sender device  
LuxIを発現→3OC6HSLをつくります。[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_F1610  BBa_F1610のregistry]
LuxIを発現→3OC6HSLをつくります。[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_F1610  BBa_F1610のregistry]
-
 
他に-butyryl-HSL,3OC14HSLを出すパーツもありますが、実際に働くかはわかりません。
他に-butyryl-HSL,3OC14HSLを出すパーツもありますが、実際に働くかはわかりません。
Line 71: Line 110:
[http://partsregistry.org/Acyl-HSLs   AHL構造]
[http://partsregistry.org/Acyl-HSLs   AHL構造]
-
'''Siganl receiver''' [[Image:Chiba-signalling.png]]
+
=====Siganl receiver=====
 +
[[Image:Chiba-signalling.png]]
*BBa_F2620(available,works)
*BBa_F2620(available,works)
Input:3OC6HSL Output:Pops
Input:3OC6HSL Output:Pops
Line 77: Line 117:
(利用法:GFP合成[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_T9002  BBa_T9002])
(利用法:GFP合成[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_T9002  BBa_T9002])
-
'''RBS'''[[Image:Chiba-rbs.png]]
+
=====RBS=====
 +
[[Image:Chiba-rbs.png]]
:RBSの翻訳速度?に違いがあるパーツがある模様…?
:RBSの翻訳速度?に違いがあるパーツがある模様…?
*[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_B0034  BBa_B0034] 基準
*[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_B0034  BBa_B0034] 基準
Line 85: Line 126:
*[http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0033        BBa_B0033] (weaker) efficiency 0.01
*[http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0033        BBa_B0033] (weaker) efficiency 0.01
-
'''Promoter'''[[Image:Chiba-promoter.png]]
+
=====Promoter=====
 +
[[Image:Chiba-promoter.png]]
*LacI regulated(induced by IPTG)
*LacI regulated(induced by IPTG)
:[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0011   BBa_R0011](pl hybrid)
:[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0011   BBa_R0011](pl hybrid)
:[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0010    BBa_R0010]
:[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0010    BBa_R0010]
-
 
-
 
----
----
-
=== ②入力の追従性を高めるためには? :冨永、香取===
+
==== ②入力の追従性を高めるためには? :冨永将大、香取崇広====
-
 
+
=====GFPのfolding時間について=====
-
*GFPのfolding時間について
+
''''superfast' GFP'''という変異体のfolding時間は、1000秒ちょっと(in vitro)だ、というデータが載ってました。また、folding時間が短いのに加えて、unfoldしにくく、GFPとしての機能をほとんど損なわないものでもあるそうです。(Fisher AC, DeLisa MP (2008) Laboratory Evolution of Fast-Folding Green Fluorescent Protein Using Secretory Pathway Quality Control. PLoS ONE 3(6): e2351. doi:10.1371/journal.pone.0002351)
''''superfast' GFP'''という変異体のfolding時間は、1000秒ちょっと(in vitro)だ、というデータが載ってました。また、folding時間が短いのに加えて、unfoldしにくく、GFPとしての機能をほとんど損なわないものでもあるそうです。(Fisher AC, DeLisa MP (2008) Laboratory Evolution of Fast-Folding Green Fluorescent Protein Using Secretory Pathway Quality Control. PLoS ONE 3(6): e2351. doi:10.1371/journal.pone.0002351)
-
*ルシフェリンをエネルギー源としてGFPを光らせる、「生物発光共鳴エネルギー移動(BRET、 Bioluminescence Resonance Energy Transfer)」という現象の利用(自ら光る蛍光タンパク質による高精度細胞イメージング技術の開発より)
+
=====ルシフェリンをエネルギー源としてGFPを光らせる=====
 +
「生物発光共鳴エネルギー移動(BRET、 Bioluminescence Resonance Energy Transfer)」という現象の利用(自ら光る蛍光タンパク質による高精度細胞イメージング技術の開発より)
ルシフェラーゼ濃度とルシフェリンの発光強度の関係には、両対数で直線になるものもある(promega:Renilla luciferase assay systemより)。ルシフェラーゼをGFPに結合させるので、foldingに時間がかかりすぎてしまう。
ルシフェラーゼ濃度とルシフェリンの発光強度の関係には、両対数で直線になるものもある(promega:Renilla luciferase assay systemより)。ルシフェラーゼをGFPに結合させるので、foldingに時間がかかりすぎてしまう。
-
*大腸菌による青色色素の合成(PATENT)
+
=====大腸菌による青色色素の合成(PATENT)=====
DCS生産性放線菌(S. lavendulae)に特異的に存在する遺伝子:bpsA (blue-pigment synthetase A)を、大腸菌に導入することによって(4'-ホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子を挿入した発現ベクター(例えば、pSTV/svp)を同時に導入し、共発現させる必要あり)、青色色素(indigoidine)を合成させることができる。生成速度、分解速度は調査中。
DCS生産性放線菌(S. lavendulae)に特異的に存在する遺伝子:bpsA (blue-pigment synthetase A)を、大腸菌に導入することによって(4'-ホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子を挿入した発現ベクター(例えば、pSTV/svp)を同時に導入し、共発現させる必要あり)、青色色素(indigoidine)を合成させることができる。生成速度、分解速度は調査中。
-
 
----
----
-
=== ③(入力に対して)リニアなプロモーターにはどんなのがある? :小林、久保 ===
+
==== ③(入力に対して)リニアなプロモーターにはどんなのがある? :小林あおい、久保 ====
-
 
+
=====2007東工大作成のハイブリットプロモーター=====
-
・2007東工大作成のハイブリットプロモーター。(ひとつはlac repressorで制御され、もう一方はAHLで活性化されます。)
+
(ひとつはlac repressorで制御され、もう一方はAHLで活性化されます。)
[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_I751101  BBa_I751101]
[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_I751101  BBa_I751101]
-
・アラビノースプロモーター
+
=====アラビノースプロモーター=====
-
 
+
(・AHL、luxRの種類の選択により、pluxの発現強度とAHL濃度にリニアな関係が得られる。)
(・AHL、luxRの種類の選択により、pluxの発現強度とAHL濃度にリニアな関係が得られる。)
-
 
-
 
----
----
-
=== ④読み出し可能な出力って? :川崎、井山===
+
==== ④読み出し可能な出力って? :川崎浩平、井山佳美====
 +
出力の種類として大まかに7つの項目でわけてみました。
 +
=====1,蛍光タンパク質=====
 +
:パーツとしてすでに多く存在。閾値を見るのになら向いてるかも・・・
 +
:色素と比べ必要な遺伝子が少ない。複雑になる回路に向いてそうです。
-
出力の種類として大まかに8つの項目でわけてみました。
+
=====2,色素=====
 +
カロテノイドなど色素を発生させるには一つの遺伝子ではできない。
 +
以下に生体由来の色素を列挙する。
 +
:カロチノイド(カロチン・キサントフィル・クリプトキサンチン)、フラボノイド(フラボン類・フラバノン・アントクロール・アントシアン・カテキン)、キノン類の色素 (メラニン) 、ポルフィリン系色素 (クロロフィル・チトクロム ・フェオホルビド・フェオポルフィリン・ヘムエリトリン・ヘモグロビン・ヘモバナジン・ヘモシアニン・ポルフィリン・ポルフィン・ミオグロビン )、フィコビリン系色素 (フィコシアニン・フィコビリン・フィコエリスリン・フィトクロム )、アリザリン、アントシアン、アントラキノン、インジゴ、ウロビリン、エリトロクルオリン、カルタミン、キサントマチン、クルクミン、クロセチン、クロリン、クロロクルオリン、クロロフィリド、ゲニステイン 、コチニール、ゴッシポール、コンメリニン、シコニン、ステルコピリン、ゼアキサンチン、タンニン、ツラシン、バクテリオクロロフィル、ビキシン、ビリベルジン、ビリルビン、ヒペリシン、ピンナグロビン、フコサンチン、ブラジリン、プルプリン、ベタシアニン、ベルベリン、ホルビリン、マンゴスチン、モリンジン、ラミナラン、レグヘモグロビン、リコピン、リトマス、ルテイン、ロドプシン、ロドキサンチン、ロドマチン
-
*①蛍光タンパク質
+
=====3,走化性=====
-
::パーツとしてすでに多く存在。閾値を見るのになら向いてるかも・・・
+
:誘引物質の刺激がないときは、CheAが活性化されていて、細胞内にある応答調節因子である CheYのアスパラギン酸残基をリン酸化し、
-
::色素と比べ必要な遺伝子が少ない。複雑になる回路に向いてそうです。
+
:リン酸化したCheYがべん毛モーターの右回転(方向転換)を起こす。つまり、細胞は方向転換してその場を離れようとする。
 +
:逆に誘引物質が受容体に結合すると、CheAは不活性のままで、リン酸化型CheYの濃度が下がり、べん毛モーターは左回転(直進)する。
 +
:一定時間直進し、方向転換してはまた直進を繰り返す大腸菌だが、誘引物質の濃度が高い方へ進んでいるときは直進する頻度が増加する。
 +
:また一定の刺激が続くと受容体が応答しにくくなるという性質により、刺激物質濃度の時間変化を検出できる。
 +
=====4,増殖系=====
 +
:増えます。
-
*②色素
+
=====5,匂い系=====
-
::・・・カロテノイドなど色素を発生させるには一つの遺伝子ではできない。
+
:大腸菌の代謝経路中で合成されるのはテルペン類(植物中に多く含まれ、総数は22000以上)、
-
'''生体由来の色素'''
+
:([http://ja.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%9E%E3%83%A1%E3%83%90%E3%83%AD%E3%83%B3%E9%85%B8%E7%B5%8C%E8%B7%AF  非メバロン酸経路])で作られるらしいです。
-
:*カロチノイド
+
:過去のigemでは[http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Edinburgh/Yoghurt  エディンバラ07]がにおいを使ってました。
-
::カロチン・キサントフィル・クリプトキサンチン
+
-
:*フラボノイド
+
-
::フラボン類・フラバノン・アントクロール・アントシアン・カテキン
+
-
:*キノン類の色素
+
-
::メラニン
+
-
:*ポルフィリン系色素
+
-
::クロロフィル・チトクロム ・フェオホルビド・フェオポルフィリン・ヘムエリトリン・
+
-
::ヘモグロビン・ヘモバナジン・ヘモシアニン・ポルフィリン・ポルフィン・ミオグロビン
+
-
:*フィコビリン系色素
+
-
::フィコシアニン・フィコビリン・フィコエリスリン・フィトクロム
+
-
:*アリザリン
+
-
:*アントシアン
+
-
:*アントラキノン
+
-
:*インジゴ
+
-
:*ウロビリン
+
-
:*エリトロクルオリン
+
-
:*カルタミン
+
-
:*キサントマチン
+
-
:*クルクミン
+
-
:*クロセチン
+
-
:*クロリン
+
-
:*クロロクルオリン
+
-
:*クロロフィリド
+
-
:*ゲニステイン
+
-
:*コチニール
+
-
:*ゴッシポール
+
-
:*コンメリニン
+
-
:*シコニン
+
-
:*ステルコピリン
+
-
:*ゼアキサンチン
+
-
:*タンニン
+
-
:*ツラシン
+
-
:*バクテリオクロロフィル
+
-
:*ビキシン
+
-
:*ビリベルジン
+
-
:*ビリルビン
+
-
:*ヒペリシン
+
-
:*ピンナグロビン
+
-
:*フコサンチン
+
-
:*ブラジリン
+
-
:*プルプリン
+
-
:*ベタシアニン
+
-
:*ベルベリン
+
-
:*ホルビリン
+
-
:*マンゴスチン (mangostin)
+
-
:*モリンジン
+
-
:*ラミナラン
+
-
:*レグヘモグロビン
+
-
:*リコピン
+
-
:*リトマス
+
-
:*ルテイン
+
-
:*ロドプシン
+
-
:*ロドキサンチン
+
-
:*ロドマチン
+
 +
=====6,シグナル系=====
 +
:ホモセリンラクトン
 +
:・・・約pH7で半減期は1000分。培地が塩基性になるとAHLのラクトン環が加水分解される。
 +
=====7,人工物質系=====
 +
:人工物質を大腸菌に作らせることができるらしい。
 +
:この機能が使えるなら、『消えない分子』の問題が解消するはず。詳細は調査中。
-
*③走化性
+
*リプレッサー候補として、今のところ以下のようなものが挙げられています。
-
::誘引物質の刺激がないときは、CheAが活性化されていて、細胞内にある応答調節因子である CheYのアスパラギン酸残基をリン酸化し、
+
**DmpR : (methyl)phenol
-
::リン酸化したCheYがべん毛モーターの右回転(方向転換)を起こす。つまり、細胞は方向転換してその場を離れようとする。
+
**PcaR : p-hydroxy benzoate
-
::逆に誘引物質が受容体に結合すると、CheAは不活性のままで、リン酸化型CheYの濃度が下がり、べん毛モーターは左回転(直進)する。
+
**CatR : cis,cis-macomater
-
::一定時間直進し、方向転換してはまた直進を繰り返す大腸菌だが、誘引物質の濃度が高い方へ進んでいるときは直進する頻度が増加する。
+
**PrmR : n-alkane
-
::また一定の刺激が続くと受容体が応答しにくくなるという性質により、刺激物質濃度の時間変化を検出できる。
+
**XylR : nitrotoluene, Toluene
 +
**AreR : Benzyl alkanoate
 +
**BenR : Bezoate
 +
**SalR : Salicylate Esters
-
*④増殖系
+
===8/3/08'''難代謝性分子'''===
-
::増えます。
+
リプレッサーとして今上がっているのが以下のとおり。
 +
これら以外にもどのような難代謝性分子やレギュレーター、そして分子の生産方法についても調べていきます。
-
*⑤匂い系
+
*DmpR : (methyl)phenol
-
::大腸菌の代謝経路中で合成されるのはテルペン類(植物中に多く含まれ、総数は22000以上)、
+
*PcaR : p-hydroxy benzoate
-
::([http://ja.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%9E%E3%83%A1%E3%83%90%E3%83%AD%E3%83%B3%E9%85%B8%E7%B5%8C%E8%B7%AF  非メバロン酸経路])で作られるらしいです。
+
*CatR : cis,cis-macomater
-
::過去のigemでは[http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Edinburgh/Yoghurt  エディンバラ07]がにおいを使ってました。
+
*PrmR : n-alkane
 +
*XylR : nitrotoluene
 +
::Toluene
 +
*AreR : Benzyl alkanoate
 +
*BenR : Bezoate
 +
*SalR : Salicylate Esters
-
*⑦シグナル系
+
*調べたこと
-
::ホモセリンラクトン
+
:*phnolの溶解度8.3 g/100 ml(20℃)[http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol [1]]
-
::・・・約pH7で半減期は1000分。培地が塩基性になるとAHLのラクトン環が加水分解される。
+
:*tyrosineからphenolを合成する反応[http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?rn:R00728 [R00728]]
 +
:*tyrosineからphenolを合成する酵素:TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)[http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?enzyme+4.1.99.2 EC 4.1.99.2 ]
 +
:*TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)の原典
 +
::*Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Purification Crystallization,and Properties :''Biol.Chem''.,'''245''',No.7,1767-1772,1970
 +
:::TPL(''Escherichia intermedia'' A-21由来)の特性について.以下の項目について説明があります。
 +
:::*stability
 +
:::*stoichiometry
 +
:::*sedimentation coefficient(20℃,water)= 7.77
 +
:::*diffusion coefficient(20℃,water)=4.42×10<sup>-7</sup>cm<sup>2</sup>/sec
 +
:::*Michaelis constant = 2.31×10<sup>-4</sup> M (基質はL-tyrosine)
 +
:::*inhibitor(L-alanine)  K<sub>i</sub>=6.53×10<sup>-3</sup> M
 +
:::*inhibitor(phenol)    K<sub>i</sub>=3.56×10<sup>-5</sup> M
 +
:::・・・他
-
*⑧人工物質系
+
::*Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Coefector Requirements:''Biol.Chem''.,'''245''',No.7,1773-1777,1970
-
::人工物質を大腸菌に作らせることができるらしい。
+
:::TPLはピリドキサルリン酸(PLPA)がないと不活性である。また、最大活性を示すには、K<sup>+</sup>およびNH<sub>4</sub><sup>+</sup>が必要。Na<sup>+</sup>により不活性化。など、TPLの機構についての説明があります。
-
::この機能が使えるなら、『消えない分子』の問題が解消するはず。詳細は調査中。
+
:*Nick J. P. Wierckx,* Hendrik Ballerstedt, Jan A. M. de Bont, and Jan Wery.Engineering of Solvent-Tolerant Pseudomonas putide S12 for Bioproduction of Phenol from Glucose:''Appl. Environ. Microbiol.'','''71''',No.12,8221-8227,2005
-
 
+
::グルコースからチロシン経由でpseudomonas putide S12で25時間後にフェノールを1.5mM生成。オクタノールの媒質二相で100時間後にフェノールを58mM生成
-
 
+
:*tyrosine biosynthesis pathway [http://www.kegg.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=ppu&mapno=00400 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis - Pseudomonas putida KT2440]
-
リプレッサー候補として、今のところ以下のようなものが挙げられています。
+
::*論文とは違う株です。
-
 
+
:*Milic Dalibor; Matkovic-Calogovic Dubravka; Demidkina Tatyana V; Kulikova Vitalia V; Sinitzina Nina I; Antson Alfred A.Structures of apo- and holo-tyrosine phenol-lyase reveal a catalytically critical closed conformation and suggest a mechanism for activation by K+ ions.''Biochemistry'','''45''',7544-7552,2006
-
*DmpR : (methyl)phenol
+
::TPLの触媒作用に重要なコンホメーションについて、およびフェノール生成反応のメカニズムについての記述があります。、
-
 
+
:*Gibson, J.M.,P. S. Thomas, J. D.Thomas, J. L. Baker, S. S. Chandran, M. K. Harrup, K. M. Draths, and J. W. Frost.Benzene-Free Synthesis of Phenol.''Angew.Chem.Int.Engle''.'''40''',1945-1948
-
*PcaR : p-hydroxy benzoate
+
::フェノールをシキミ酸から合成。
-
 
+
-
*CatR : cis,cis-macomater
+
-
 
+
-
*PrmR : n-alkane
+
-
 
+
-
*XylR : nitrotoluene
+
-
 
+
-
:Toluene
+
-
 
+
-
*AreR : Benzyl alkanoate
+
-
 
+
-
*BenR : Bezoate
+
-
 
+
-
*SalR : Salicylate Esters
+
-
 
+
-
=='''勉強会'''==
+
-
 
+
-
::今までの勉強会についての簡単なログです。
+
-
 
+
-
===6/28/08 メール勉強会===
+
-
*色素について
+
-
 
+
-
===6/26/08 第6回勉強会===
+
-
 
+
-
===5/30/08 Wiki講習会===
+
-
 
+
-
===5/03/08 第7回事例研究===
+
-
 
+
-
===5/02/08 第6回事例研究===
+
-
 
+
-
===5/01/08 第5回事例研究===
+
-
 
+
-
===4/28/08 第4回事例研究===
+
-
 
+
-
===4/25/08 第5回勉強会&第3回事例研究===
+
-
 
+
-
===4/22/08 第2回事例研究===
+
-
 
+
-
===4/18/08 第1回事例研究===
+
-
 
+
-
===4/17/08 第4回iGEM勉強会===
+
-
 
+
-
===4/14/08 第3回iGEM勉強会===
+
-
 
+
-
===4/11/08 第2回iGEM勉強会===
+
-
 
+
-
 
+
-
 
+
-
===4/09/08 第1回iGEM勉強会===
+
-
*「iGEMとはなにか?」
+
-
*プレ事前研究
+

Revision as of 09:59, 18 December 2008

Contents

勉強会

今までの勉強会についての簡単なログです。

4/09/08 第1回iGEM勉強会

  • 「iGEMとはなにか?」
  • プレ事前研究

4/11/08 第2回iGEM勉強会

  • 「細胞、微生物学・細胞ロボットとは?」

4/14/08 第3回iGEM勉強会

  • 「セントラルドグマとは?」

4/17/08 第4回iGEM勉強会

  • 「転写制御:Lacオペロンとは?」

4/18/08 第1回事例研究

【事例研究担当】

4/22/08 第2回事例研究

  • 2年生、実際に大腸菌を見せてもらう。

【事例研究担当】

  • 川崎 imperial 2007

4/25/08 第5回勉強会&第3回事例研究

  • 「biobrickと遺伝子回路」

4/28/08 第4回事例研究

【事例研究担当】

  • 久保 Penn state 2006
  • 杉山 Mississippi 2006

5/01/08 第5回事例研究

【事例研究担当】

  • 冨永 Peking 2007
  • 小林 Rice 2007

5/02/08 第6回事例研究

【事例研究担当】

  • 福冨 MIT 2007
  • 井山 Toront 2007

5/03/08 第7回事例研究

【事例研究担当】

  • 川崎 Berkley 2006

5/30/08 Wiki講習会

  • [http://ja.wikipedia.org/wiki/Wikipedia:%E7%B7%A8%E9%9B%86%E3%81%AE%E4%BB%95%E6%96%B9#.E7.94.BB.E5.83.8F.E3.83.BB.E9.9F.B3.E5.A3.B0.E3.83.BB.E5.8B.95.E7.94.BB wikipedia-Wikiの編集の仕方]
  • 英語版Chibaメインページ

6/7/08 第1回ポスター発表

  • Project 1 仇討ち大腸菌   冨永将大/小林あおい
  • Project 2 Memory Protector   福冨浩樹/杉山まい
  • Project 3 Electro Bio Graphics  久保喬義
  • Project 4 Etch o sketi  川崎浩平
  • Project 5 The Integral E.coil   井山佳美
  • Project 6 Invisible Picture  香取崇広

6/26/08 第6回勉強会

  • 「蛍光タンパク」

6/28/08 メール勉強会

  • 「色素について」
色素となる蛋白にはどのようなものがあるのか(大腸菌の出すことができる色素はどのようなものがあるか。)
大腸菌の色素合成システム


ルーキーのための勉強会

勉強会責任者

  • 第1回 責任者:川崎浩平  使用テキスト「30 DNAの転写」
  • 第2回 責任者:香取崇広  使用テキスト「31 転写調節」←アテニュエーターの部分は削除
  • 第3回 責任者:杉山まい  使用テキスト「33 タンパク質の生合成」
  • 第4回 責任者:井山佳美  使用テキスト「現代化学 P.57 Fig.2 P.58 Fig.3」
  • 第5回 責任者:久保喬義  使用テキスト「現代化学 P.58 Fig.4 P59 Fig.5」

日程

場所:1号棟3階ゼミ室

  • 第1回 5/1(木)
  • 第2回 5/2(金)
  • (できれば5/5(祝)もやります)
  • 第3回 5/8(木)
  • 第4回 5/9(金)
  • 第5回 5/12(月)

進度について

毎回の勉強会で理解できない人が出た場合、次の勉強会でもまた同じ内容について学びます。全員が理解した状態で初めて次に進めます。また梅野先生の研究室のそばで学ぶので、不明な点が出た場合はすぐに聞きにいきましょう。その場合はわからないところを紙に書き出して、いっぺんに聞きに行くこと。

テキストについて

当初予定にあった「RNAプロセシング」や「エネルギー代謝(この系列のプリントはいらないらしい)」については学ぶ必要がなく、上記にあげた資料のみ理解できれば十分だそうです。できるだけ少ないテキストで勉強し、短時間で戦えるようになりたいので、これ以上資料は増やしません。何か足りない場合は梅野先生が随時資料を提供してくれるそうです。

責任者について

各回の進行役は責任者が行います。

責任者は予習をする際、他のテキストを使用してもかまいませんが、必ずその項目と同じような表記の部分だけを読み物程度に参考にするようにしてください。

例)「DNAの転写」なら他のテキストでも「DNAの転写」の部分だけを参考にする。
また責任者が間違っているのに気づかず進んでしまうことを防ぐためにもサブリーダーを各回1~2人おくことにします。サブリーダーも責任者と同様、同じ項目について皆に説明出来るよう予習をしてきます。ただし予習の段階で責任者とは一緒に勉強をしないでください。
とりあえず、第1回目のサブリーダーは香取君。 2回目は久保君が引き受けてくれました。(と思っています)

また3年生の小林さんがサブリーダーとして、可能な範囲内で参加してくださるそうです。


調べものノート

7/1/08調べ学習

①バイオブリックパーツを挙げる :福冨浩樹、杉山まい

Sender signal

Chiba-signalling.png

  • BBa_F1610(available,works)

3OC6HSL Sender device

LuxIを発現→3OC6HSLをつくります。[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_F1610 BBa_F1610のregistry]

他に-butyryl-HSL,3OC14HSLを出すパーツもありますが、実際に働くかはわかりません。

また、構造が似ているため混信してしまう可能性あり。 [http://partsregistry.org/Acyl-HSLs   AHL構造]

Siganl receiver

Chiba-signalling.png

  • BBa_F2620(available,works)

Input:3OC6HSL Output:Pops

(利用法:GFP合成[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_T9002  BBa_T9002])

RBS

Chiba-rbs.png

RBSの翻訳速度?に違いがあるパーツがある模様…?
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_B0034 BBa_B0034] 基準
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_B0030 BBa_B0030] (strong) efficiency 0.6
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0032 BBa_B0032] (medium) efficiency 0.3
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0031 BBa_B0031] (weak) efficiency 0.07
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0033 BBa_B0033] (weaker) efficiency 0.01
Promoter

Chiba-promoter.png

  • LacI regulated(induced by IPTG)
[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0011   BBa_R0011](pl hybrid)
[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0010 BBa_R0010]

②入力の追従性を高めるためには? :冨永将大、香取崇広

GFPのfolding時間について

'superfast' GFPという変異体のfolding時間は、1000秒ちょっと(in vitro)だ、というデータが載ってました。また、folding時間が短いのに加えて、unfoldしにくく、GFPとしての機能をほとんど損なわないものでもあるそうです。(Fisher AC, DeLisa MP (2008) Laboratory Evolution of Fast-Folding Green Fluorescent Protein Using Secretory Pathway Quality Control. PLoS ONE 3(6): e2351. doi:10.1371/journal.pone.0002351)

ルシフェリンをエネルギー源としてGFPを光らせる

「生物発光共鳴エネルギー移動(BRET、 Bioluminescence Resonance Energy Transfer)」という現象の利用(自ら光る蛍光タンパク質による高精度細胞イメージング技術の開発より) ルシフェラーゼ濃度とルシフェリンの発光強度の関係には、両対数で直線になるものもある(promega:Renilla luciferase assay systemより)。ルシフェラーゼをGFPに結合させるので、foldingに時間がかかりすぎてしまう。


大腸菌による青色色素の合成(PATENT)

DCS生産性放線菌(S. lavendulae)に特異的に存在する遺伝子:bpsA (blue-pigment synthetase A)を、大腸菌に導入することによって(4'-ホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子を挿入した発現ベクター(例えば、pSTV/svp)を同時に導入し、共発現させる必要あり)、青色色素(indigoidine)を合成させることができる。生成速度、分解速度は調査中。


③(入力に対して)リニアなプロモーターにはどんなのがある? :小林あおい、久保

2007東工大作成のハイブリットプロモーター

(ひとつはlac repressorで制御され、もう一方はAHLで活性化されます。) [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_I751101 BBa_I751101]

アラビノースプロモーター

(・AHL、luxRの種類の選択により、pluxの発現強度とAHL濃度にリニアな関係が得られる。)


④読み出し可能な出力って? :川崎浩平、井山佳美

出力の種類として大まかに7つの項目でわけてみました。

1,蛍光タンパク質
パーツとしてすでに多く存在。閾値を見るのになら向いてるかも・・・
色素と比べ必要な遺伝子が少ない。複雑になる回路に向いてそうです。
2,色素

カロテノイドなど色素を発生させるには一つの遺伝子ではできない。

以下に生体由来の色素を列挙する。

カロチノイド(カロチン・キサントフィル・クリプトキサンチン)、フラボノイド(フラボン類・フラバノン・アントクロール・アントシアン・カテキン)、キノン類の色素 (メラニン) 、ポルフィリン系色素 (クロロフィル・チトクロム ・フェオホルビド・フェオポルフィリン・ヘムエリトリン・ヘモグロビン・ヘモバナジン・ヘモシアニン・ポルフィリン・ポルフィン・ミオグロビン )、フィコビリン系色素 (フィコシアニン・フィコビリン・フィコエリスリン・フィトクロム )、アリザリン、アントシアン、アントラキノン、インジゴ、ウロビリン、エリトロクルオリン、カルタミン、キサントマチン、クルクミン、クロセチン、クロリン、クロロクルオリン、クロロフィリド、ゲニステイン 、コチニール、ゴッシポール、コンメリニン、シコニン、ステルコピリン、ゼアキサンチン、タンニン、ツラシン、バクテリオクロロフィル、ビキシン、ビリベルジン、ビリルビン、ヒペリシン、ピンナグロビン、フコサンチン、ブラジリン、プルプリン、ベタシアニン、ベルベリン、ホルビリン、マンゴスチン、モリンジン、ラミナラン、レグヘモグロビン、リコピン、リトマス、ルテイン、ロドプシン、ロドキサンチン、ロドマチン
3,走化性
誘引物質の刺激がないときは、CheAが活性化されていて、細胞内にある応答調節因子である CheYのアスパラギン酸残基をリン酸化し、
リン酸化したCheYがべん毛モーターの右回転(方向転換)を起こす。つまり、細胞は方向転換してその場を離れようとする。
逆に誘引物質が受容体に結合すると、CheAは不活性のままで、リン酸化型CheYの濃度が下がり、べん毛モーターは左回転(直進)する。
一定時間直進し、方向転換してはまた直進を繰り返す大腸菌だが、誘引物質の濃度が高い方へ進んでいるときは直進する頻度が増加する。
また一定の刺激が続くと受容体が応答しにくくなるという性質により、刺激物質濃度の時間変化を検出できる。
4,増殖系
増えます。
5,匂い系
大腸菌の代謝経路中で合成されるのはテルペン類(植物中に多く含まれ、総数は22000以上)、
([http://ja.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%9E%E3%83%A1%E3%83%90%E3%83%AD%E3%83%B3%E9%85%B8%E7%B5%8C%E8%B7%AF 非メバロン酸経路])で作られるらしいです。
過去のigemでは[http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Edinburgh/Yoghurt エディンバラ07]がにおいを使ってました。
6,シグナル系
ホモセリンラクトン
・・・約pH7で半減期は1000分。培地が塩基性になるとAHLのラクトン環が加水分解される。
7,人工物質系
人工物質を大腸菌に作らせることができるらしい。
この機能が使えるなら、『消えない分子』の問題が解消するはず。詳細は調査中。
  • リプレッサー候補として、今のところ以下のようなものが挙げられています。
    • DmpR : (methyl)phenol
    • PcaR : p-hydroxy benzoate
    • CatR : cis,cis-macomater
    • PrmR : n-alkane
    • XylR : nitrotoluene, Toluene
    • AreR : Benzyl alkanoate
    • BenR : Bezoate
    • SalR : Salicylate Esters


8/3/08難代謝性分子

リプレッサーとして今上がっているのが以下のとおり。

これら以外にもどのような難代謝性分子やレギュレーター、そして分子の生産方法についても調べていきます。

  • DmpR : (methyl)phenol
  • PcaR : p-hydroxy benzoate
  • CatR : cis,cis-macomater
  • PrmR : n-alkane
  • XylR : nitrotoluene
Toluene
  • AreR : Benzyl alkanoate
  • BenR : Bezoate
  • SalR : Salicylate Esters


  • 調べたこと
  • phnolの溶解度8.3 g/100 ml(20℃)[http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol [1]]
  • tyrosineからphenolを合成する反応[http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?rn:R00728 [R00728]]
  • tyrosineからphenolを合成する酵素:TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)[http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?enzyme+4.1.99.2 EC 4.1.99.2 ]
  • TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)の原典
  • Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Purification Crystallization,and Properties :Biol.Chem.,245,No.7,1767-1772,1970
TPL(Escherichia intermedia A-21由来)の特性について.以下の項目について説明があります。
  • stability
  • stoichiometry
  • sedimentation coefficient(20℃,water)= 7.77
  • diffusion coefficient(20℃,water)=4.42×10-7cm2/sec
  • Michaelis constant = 2.31×10-4 M (基質はL-tyrosine)
  • inhibitor(L-alanine) Ki=6.53×10-3 M
  • inhibitor(phenol) Ki=3.56×10-5 M
・・・他
  • Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Coefector Requirements:Biol.Chem.,245,No.7,1773-1777,1970
TPLはピリドキサルリン酸(PLPA)がないと不活性である。また、最大活性を示すには、K+およびNH4+が必要。Na+により不活性化。など、TPLの機構についての説明があります。
  • Nick J. P. Wierckx,* Hendrik Ballerstedt, Jan A. M. de Bont, and Jan Wery.Engineering of Solvent-Tolerant Pseudomonas putide S12 for Bioproduction of Phenol from Glucose:Appl. Environ. Microbiol.,71,No.12,8221-8227,2005
グルコースからチロシン経由でpseudomonas putide S12で25時間後にフェノールを1.5mM生成。オクタノールの媒質二相で100時間後にフェノールを58mM生成
  • tyrosine biosynthesis pathway [http://www.kegg.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=ppu&mapno=00400 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis - Pseudomonas putida KT2440]
*論文とは違う株です。
  • Milic Dalibor; Matkovic-Calogovic Dubravka; Demidkina Tatyana V; Kulikova Vitalia V; Sinitzina Nina I; Antson Alfred A.Structures of apo- and holo-tyrosine phenol-lyase reveal a catalytically critical closed conformation and suggest a mechanism for activation by K+ ions.Biochemistry,45,7544-7552,2006
TPLの触媒作用に重要なコンホメーションについて、およびフェノール生成反応のメカニズムについての記述があります。、
  • Gibson, J.M.,P. S. Thomas, J. D.Thomas, J. L. Baker, S. S. Chandran, M. K. Harrup, K. M. Draths, and J. W. Frost.Benzene-Free Synthesis of Phenol.Angew.Chem.Int.Engle.40,1945-1948
フェノールをシキミ酸から合成。