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Team:Chiba/jk/α
From 2008.igem.org
入力班のぺーじ。
Contents |
2008.8.20
PCR:PCR
・BBa_J22136(2007)①
・BBa_J22136(2008)②
・BBa_J22141(2007)③
・BBa_J22141(2008)④
・BBa_E0612(2008)⑤
| Sample No | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
| DNA tamplate | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
| FW primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| VR primer | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| dNTPmix | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| thermo pol buffer | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| DNA pol(VENT) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| dH2O | 68 | 68 | 68 | 68 | 68 |
| TOTAL | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
→gel check:Gel Check
| Sample No | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ |
| Sample DNA | 1 | 1 | 1 | 1 | >1 |
| loading dye | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| dH2O | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Total | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
→どれもバンド出ず。
trnsformation:Transformation
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(１個のみ)
2008.8.21
8.20にtransformationしたもの
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
を２ml培養、12h。ただしコロニーが１個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、
さらに1h培養した。
2008.8.22
mini prep:Mini Prep
2ml培養した
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
をミニプレした。
insert check:Digestion
BBa_J06650(2006)
BBa_J06650(2007)
BBa_J22136(2007)
BBa_J22141(2007)
BBa_R0051(2006)
BBa_R0051(2007)
BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。
混ぜ表
| double | simgle | |
| dH2O | 14 | 25 |
| 10×BSA | 7 | 10 |
| 10×NE | 7 | 10 |
| EcoRI | 3.5 | 5 |
| PstI | 3.5 | - |
2008.8.25
BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり
プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。
| OD=0.495培養液 | 0.67μl |
| 60%グリセロール | 0.33μl |
| 20%グリセロールストック(計) | 1.00ml |
2008.8.28
transformation:Transformation
BBa_I7106(2007)
生えてきたコロニーを10ml培養してmini prep(60mlで溶出):mini Prep
→Digestion:Digestion
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 2 |
| 10×BSA | 1 |
| 10×NE | 1 |
| EcoRI | 0.5 |
| PstI | 0.5 |
| DNA | 5 |
| TOTAL | 10 |
Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl
PCR:PCR
RBS＋CI
混ぜ表
| DNA | 1 |
| FW primer | 2.5 |
| VR primer | 2.5 |
| dNTPmix | 5 |
| thermo pol buffer | 5 |
| DNA pol(VENT) | 1 |
| dH2O | 34 |
| TOTAL | 50 |
ゲルチェック:Gel Check
| PCR産物 | 1 |
| Dye | 1 |
| dH2O | 4 |
| TOTAL | 6 |
→濃度は33.6ng/μg
ベクターのPCR:PCR
BBa_I7106
混ぜ表
| DNA | 1 |
| FW primer | 5 |
| VR primer | 5 |
| dNTPmix | 10 |
| thermo pol buffer | 10 |
| DNA pol(VENT) | 1 |
| dH2O | 68 |
| TOTAL | 100 |
ゲルチェック:Gel Check
| PCR産物 | 1 |
| Dye | 1 |
| dH2O | 4 |
| TOTAL | 6 |
→バンド出ず。
2008.8.30
Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 6 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| XbaI | 2 |
| DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
| TOTAL | 60 |
→30μlゲル抽出
→ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 4 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| SpeI | 4 |
| DNA | 75ng/μl×30μl(2μg) |
| TOTAL | 60 |
→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
→SAP:SAP
混ぜ表
| dH2O | 9 |
| DNA | 10 |
| SAP | 1 |
| SAP Buffer | 10 |
| TOTAL | 30 |
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
Ligation:Ligation
混ぜ表
| b.g | ||
| dH2O | 1.4 | 8 |
| Ligase | 1 | 1 |
| Ligase Buffer | 2 | 2 |
| Vector | 1.8 | 1 |
| Insert | 3 | - |
| TOTAL | 10 | 10 |
→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)
コロニーPCR(16コつつく):ColonyPCR
混ぜ表
| VF | 2 |
| VFR | 2 |
| dNTP | 2 |
| thermo pol buffer | 2 |
| Tag | 0.3 |
| dH2O | 11.7 |
| TOTAL | 20 |
→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
→mini prep:Mini Prep
Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 6 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| XbaI | 2 |
| DNA | 33.6ng/μl×30μl(1μg) |
| TOTAL | 60 |
ゲル抽出:Gel Extraction
混ぜ表
| Digestion産物 | 30 |
| Dye | 6 |
| TOTAL | 36 |
→Zymo:Zymo
→NFW5μlで溶出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表
| dH2O | 4 |
| DNA | 1 |
| Dye | 1 |
| TOTAL | 6 |
→ゲルチェックOK
Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表
| double | |
| dH2O | 4 |
| 10×BSA | 10 |
| 10×NE | 10 |
| PstI | 2 |
| SpeI | 4 |
| DNA | 75ng/μl×30μl(2.25μg) |
| TOTAL | 60 |
ゲル抽出:Gel Extraction
混ぜ表
| Digestion産物 | 30 |
| Dye | 6 |
| TOTAL | 36 |
→Zymo:Zymo
→NFW10μlで溶出
→SAP:SAP
混ぜ表
| dH2O | 9 |
| DNA | 10 |
| SAP | 1 |
| SAP Buffer(×10) | 10 |
| TOTAL | 30 |
→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
→Zymo:Zymo
→NFW5μlで抽出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表
| dH2O | 4 |
| DNA | 1 |
| Dye | 1 |
| TOTAL | 6 |
→ゲルチェックOK
Ligation:Ligation
混ぜ表
| b.g | ||
| dH2O | 1.4 | 8 |
| Ligase | 1 | 1 |
| Ligase Buffer | 2 | 2 |
| Vector | 1.8 | 1 |
| Insert | 3 | - |
| TOTAL | 10 | 10 |
→25℃で2h放置
→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)
2008.9.1
・Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
結果→GFPが発現していた。
→-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
混ぜ表
| Double | Single | |
| dH2O | 1 | 2 |
| XbaI | 1 | 1 |
| SpeI | 1 | - |
| BSA(×10) | 1 | 1 |
| NEB(×10) | 1 | 1 |
| DNA | 5 | 5 | TOTAL | 10 | 10 |
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