Team:Chiba/jk/β

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'''β班の実験ノート'''
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<html><link rel="stylesheet" href="https://2008.igem.org/wiki/index.php?title=User:Maiko/chiba.css&action=raw&ctype=text/css" type="text/css" /></html>
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>[[Team:Chiba/Internal|ノートに戻る]]
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==Week 1==
 
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*17 August, 2008
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==送受信班の実験ノート==
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:[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transforation]]
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 1|week 1]]
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_R0040| BBa_R0040](2008) -> No colonies on plates
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 2|week 2]]
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2008) -> No colonies on plates
+
*[[Team:Chiba/jk/β/week 3|week 3]]
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2008) -> No colonies on plates
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 4|week 4]]
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0077| BBa_C0077](2008) -> No colonies on plates
+
*[[Team:Chiba/jk/β/week 5|week 5]]
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2008) -> No colonies on plates
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*[[Team:Chiba/jk/β/week 6|week 6]]
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0079| BBa_C0079](2008) -> No colonies on plates
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==モジュール解説==
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===感度差による応答時間の差===
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任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。
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*18 August, 2008
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=== Controlling the Delay time of the AHL signaling ===
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::[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transforation]]
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LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2007)
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#LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合<br>LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。[http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.''et al.:''Mol.Microbiol.2005.'''55'''(3).712–723]
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2006)
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#クロストークを使う場合
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2007)
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:AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2006) -> No colonies on plates
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0170| BBa_C0170](2007)
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0170| BBa_C0170](2006)
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0178| BBa_C0178](2007)
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0178| BBa_C0178](2006)
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*AHLsおよびその合成酵素
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<table width="500" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000" center>
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<tr>
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<td width="200">Strain</td>
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<td width="200">Signal Molecule</td>
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<td width="150">Enzyme<td>
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</tr>
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<tr>
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<td>P.aeruginosa</td>
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<td>C4-HSL</td>
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<td>RhlI</td>
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</tr>
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<tr>
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<td>V. fisheri</td>
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<td>C6-3-oxo-HSL</td>
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<td>LuxI</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>A.tumefaciens</td>
 +
<td>C8-3-oxo-HSL</td>
 +
<td>TraI</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>P.aeruginosa</td>
 +
<td>C10-3-oxo-HSL</td>
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<td>VanI</td>
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</tr>
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*19 August, 2008
+
<tr>
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:[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]
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<td>P.aeruginosa</td>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9026| BBa_I9026](2007)
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<td>C12-3-oxo-HSL</td>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9026| BBa_I9026](2006)
+
<td>LasI</td>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9030| BBa_I9030](2007)
+
</tr>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9030| BBa_I9030](2006)
+
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_S3154| BBa_S3154](2007)
+
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_S3154| BBa_S3154](2006)
+
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620| BBa_F2620](2007)･･･control
+
-
:[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]
+
<tr>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9026| BBa_I9026](2007)
+
<td>R.leguminosarum</td>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9026| BBa_I9026](2006)
+
<td>C14-3-hydroxy-HSL</td>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9030| BBa_I9030](2007)
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<td>CinI</td>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_I9030| BBa_I9030](2006)
+
</tr>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_S3154| BBa_S3154](2007)
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</table>
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_S3154| BBa_S3154](2006)
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[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity AHLsについて]
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620| BBa_F2620](2007)
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==実験==
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===Construction(From BioBrick)===
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:*Sender(Autoinducer synthase)
 +
::LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
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:*Receiver
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::LuxR,LasR,CinR,RhlR
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*20 August, 2008
 
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:[[Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma|Mini prep]]
 
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2007)
 
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2006)
 
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2007)
 
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2007)
 
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2006)
 
-
:[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]
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===Cross-Talk Check===
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0170| BBa_C0170](2007)
+
#LuxR vs LuxI('''OK'''),LasI('''OK'''),CinI('''No'''),RhlI('''OK''')
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0170| BBa_C0170](2006)
+
#LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR-->発現を確認できず
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0178| BBa_C0178](2007)
+
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0178| BBa_C0178](2006)
+
-
:[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]
+
===time-delay test===
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2007)
+
[[Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j|time-delay protocol]]
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2006)
+
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2007)
+
-
::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2007)
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2006)
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 +
==連絡==
 +
===pptに載せたいもの===
 +
====作ったもの====
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*絵で、わかりやすく。～Isごとに色を変える。
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====time-delay実験結果の整理(25/9)====
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*実験操作を分かりやすく書く
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*比較するもの
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**LuxI,LasI,RhlI
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**TAG有/無
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**温度
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**菌数比
 +
**株
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*ポイント
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#正しく書きだす
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#推論を立てる（帰納的に、結論を急がないこと）
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====固体培地spot実験(28/9)====
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前日
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*IPTG入りLB-Agar-amp（20ml）に、T9002を2ml(10<sup>3</sup>-10<sup>5</sup> cells/2ml)撒く-->37℃,O/N
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*～Is（5種類）をLB-Amp,2ml培養
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当日
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*T9002がコロニーを形成したプレートの中心に、~Isの培養液を1μl,spotする。
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*gfpの発現が同心円状に広がっていく。その計時変化を記録する。
-
*21 August, 2008
 
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:[[Team:Chiba/protocol/PCR|PCR]]
 
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2007)
 
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2006)
 
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2007)
 
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2007)
 
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2006)
 
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:[[Team:Chiba/protocol/gelcheck|Gel Check]]
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{| style="color:white;" cellpadding="3" cellspacing="3" border="0" width="100%" align="center" class="menu" |
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2007)
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0070| BBa_C0070](2006)
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2007) -> None
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2007) -> None
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2006) -> None
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:[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transforation]]
+
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:(Locate & 2 Punch ~iyama ver.~)
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0076| BBa_C0076](2008) -> No colonies on plates
+
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0077| BBa_C0077](2008) -> No colonies on plates
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::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_C0078| BBa_C0078](2008) -> No colonies on plates
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*22 August, 2008
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*23 August, 2008
+
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+
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==Week 2==
+
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*27 August, 2008
+
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:Colony PCR of 5 colonies from ligation plates (27/8) and one from control plate([http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620| BBa_F2620](2007)).
+
-
 
+
-
==Week 3==
+
-
 
+
-
==reference==
+
-
*L. Steindler.V.Venturi.:Detection of quorum sensing N-acyl homoserine lactone.FEMS Microbiol Lett '''266''' (2007) 1-9
+
-
:クオラムセンシングのクロストークについてのミニレビュー。クオラムセンシングを利用したAHLバイオセンサーについて、Table 1.にまとまっている。
+
-
 
+
-
*M.K Winson ''et al''.Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors
+
-
for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing.FEMS Microbiology Letters 163 (1998) 185-192
+
-
:Figure 2.hは、LuxR、RhlR、LasRそれぞれの、C4-C14のN-acyl-L-homoserine lactone,C4-C14のN-(3-oxoacyl)-L-homoserine lactoneに対する感受性を比較したグラフ。
+
-
 
+
-
*Michiko E. Taga. Bonnie L. Bassler.:Chemical communication among bacteria.PNAS.November 25, 2003 �'''100''' �suppl.2 �
+
-
:クオラムセンシングについての総説。アシル基の異なるAHL、およびそのシンターゼの紹介、AIPを用いたコミュニケーション、AiiA（AHL分解酵素）についてのまとめがある。
+
-
 
+
-
*K.M.GRAY ''et al''.Interchangeability and Specificity of Components from the Quorum-Sensing Regulatory Systems of Vibrio fischeri and Pseudomonas aeruginosa.J.BACTERIOL.'''176''',1994,3076-3080
+
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:LasとLuxのクロストークについて調べた論文。Table 1とTable 2で、promotor、レセプタータンパク質、インデューサーそれぞれを交換して、レポーターの発現の様子を調べている。
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*FK Balagadde ''et al''.:A synthetic predator–prey ecosystem.Molecular Systems Biology 4:187,2008
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:LuxとLasによるクオラムセンシングを利用した、プレデター・プレイモデル。LuxとLasのクロストークについて言及あり。
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{| style="color:white;background-color:Maroon" cellpadding="3" cellspacing="3" border="1" bordercolor="white" width="100%" align="center"
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!align="center"|[[Team:Chiba/j|ホーム]]
!align="center"|[[Team:Chiba/j|ホーム]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
-
!align="center"|[[Team:Chiba/Parts/j|Parts Submitted to the Registry]]
+
!align="center"|[[Team:Chiba/Parts/j|作成したDNAパーツ]]
-
!align="center"|[[Team:Chiba/Modeling/j|モデリング]]
+
!align="center"|[[Team:Chiba/Internal|ノート]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Internal|ノート]]
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Latest revision as of 11:27, 14 December 2008

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Contents

送受信班の実験ノート

モジュール解説

感度差による応答時間の差

任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。

Controlling the Delay time of the AHL signaling

LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。

  1. LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合
    LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。C. H. Collins.et al.:Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723
  2. クロストークを使う場合
AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。
  • AHLsおよびその合成酵素
Strain Signal Molecule Enzyme
P.aeruginosa C4-HSL RhlI
V. fisheri C6-3-oxo-HSL LuxI
A.tumefaciens C8-3-oxo-HSL TraI
P.aeruginosa C10-3-oxo-HSL VanI
P.aeruginosa C12-3-oxo-HSL LasI
R.leguminosarum C14-3-hydroxy-HSL CinI

AHLsについて

実験

Construction(From BioBrick)

  • Sender(Autoinducer synthase)
LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
  • Receiver
LuxR,LasR,CinR,RhlR


Cross-Talk Check

  1. LuxR vs LuxI(OK),LasI(OK),CinI(No),RhlI(OK)
  2. LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR-->発現を確認できず

time-delay test

time-delay protocol

連絡

pptに載せたいもの

作ったもの

  • 絵で、わかりやすく。～Isごとに色を変える。

time-delay実験結果の整理(25/9)

  • 実験操作を分かりやすく書く
  • 比較するもの
    • LuxI,LasI,RhlI
    • TAG有/無
    • 温度
    • 菌数比
    • 株
  • ポイント
  1. 正しく書きだす
  2. 推論を立てる（帰納的に、結論を急がないこと）

固体培地spot実験(28/9)

前日

  • IPTG入りLB-Agar-amp（20ml）に、T9002を2ml(103-105 cells/2ml)撒く-->37℃,O/N
  • ～Is（5種類）をLB-Amp,2ml培養

当日

  • T9002がコロニーを形成したプレートの中心に、~Isの培養液を1μl,spotする。
  • gfpの発現が同心円状に広がっていく。その計時変化を記録する。


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