Team:Chiba/jk/γ/trs

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(New page: ==Time Responce Liquid== '''装置&試薬''' *装置 :*固体培地(0.2%glucouse,IPTG,AHL,X-gal) *試薬 :*IPTG(pLac) :*AHL(pLux) :*X-gal(Lacz) :*ニトロセルロースフィルター '...)
(Time Responce Liquid)
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==Time Responce Liquid==
==Time Responce Liquid==
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'''装置&試薬'''
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===Reporter===
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*装置
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*Fluorescent Protein
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:*固体培地(0.2%glucouse,IPTG,AHL,X-gal)
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:*GFP
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::*pGFPuv
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::BBa_T9002 
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:*Venus YFP
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::*BBa_K084003 
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:::*pLac-Venus YFP
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:*mCherry
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pLac-mCherry
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*β-gal (X-gal assay)
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:*pUC19(plac-LacZα)
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*試薬
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===Equipment===
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:*IPTG(pLac)
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:shaking incubator
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:*AHL(pLux)
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::Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)
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:*X-gal(Lacz)
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:*ニトロセルロースフィルター
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'''プロトコル'''
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<br>0.2%glucouse入り培地に菌をまく(12時間)
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<br>固体培地(IPTG,AHL,X-gal)にニトロセルロースフィルターを使ってコロニーリフトする。
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<br>0min,30min,60min,90min,120min,150min,,,,,240minごとに変化があるか確認する。
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'''Result'''
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===Method===
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[[Image:Reporter method Chiba.jpg|rifht|thumb|'''Fig. '''レポーターのタイムレスポンスの実験方法]]
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Strain:XL10G Kan<sup>R</sup>
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*Agar plate experiment
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#Pre-culture
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##Picked and cultured the following plate stocks in 2mL of LB:
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###LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
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###LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
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##Cultured at 37°C for 12h.
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#Spread on plate
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##Spread on new plate
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###LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
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###LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
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##Cultured at 37°C for 12h.
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#Colony lift
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##Colony lift to inducible agar plate (containing IPTG or AHL)
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###LB-Amp+0.2 mM IPTG agar plate, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
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###LB-Amp+100 nM AHL agar plate, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
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##Incubate at 37 °C
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#Check expression every 30 min.
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===Result===
*[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0829|29,August,2008]]
*[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0829|29,August,2008]]
*[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0902|2,September,2008]]
*[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0902|2,September,2008]]
*[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0910|10,September,2008]]
*[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0910|10,September,2008]]
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===Discussion===
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このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である
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*X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間より遅い
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*X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる
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以上の2つの理由から蛍光タンパク質が適している
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またGFP,YFPの発現時間までのタイムラグが一番少なかった
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*目視で確認した際、GFPのほうがYFPよりも目視で確認するのが容易であった
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以上の理由から、出力はGFPとする。
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Revision as of 02:01, 30 October 2008

Contents

Time Responce Liquid

Reporter

  • Fluorescent Protein
  • GFP
  • pGFPuv
BBa_T9002
  • Venus YFP
  • BBa_K084003
  • pLac-Venus YFP
  • mCherry

pLac-mCherry

  • β-gal (X-gal assay)
  • pUC19(plac-LacZα)

Equipment

shaking incubator
Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)


Method

Fig. レポーターのタイムレスポンスの実験方法

Strain:XL10G KanR

  • Agar plate experiment
  1. Pre-culture
    1. Picked and cultured the following plate stocks in 2mL of LB:
      1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
      2. LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
    2. Cultured at 37°C for 12h.
  2. Spread on plate
    1. Spread on new plate
      1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
      2. LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
    2. Cultured at 37°C for 12h.
  3. Colony lift
    1. Colony lift to inducible agar plate (containing IPTG or AHL)
      1. LB-Amp+0.2 mM IPTG agar plate, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
      2. LB-Amp+100 nM AHL agar plate, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
    2. Incubate at 37 °C
  4. Check expression every 30 min.


Result


Discussion

このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である

  • X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間より遅い
  • X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる

以上の2つの理由から蛍光タンパク質が適している

またGFP,YFPの発現時間までのタイムラグが一番少なかった

  • 目視で確認した際、GFPのほうがYFPよりも目視で確認するのが容易であった

以上の理由から、出力はGFPとする。




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