Nasze plany

Na początku należy uprzedzić że nasze pierwsze plany w pewnej mierze rozminęły się z tym co w końcu zrobiliśmy. A plany mieliśmy naprawdę niesamowite: chcieliśmy stworzyć układ maszyn biologicznych, które umożliwiały badanie oddziaływań białek przy jednoczesnej próbie zmiany sekwencji jednego z nich tak aby znaleźć najsilniejsze możliwe oddziaływanie. Cały układ miał wyglądać mniej więcej następująco. Sekwencja DNA badanego białka lub cała biblioteka takich sekwencji umieszczona na nisko kopijnym plazmidzie miała zostać transformowana do szczepu w którym ta sekwencja ulegałaby stosunkowo częstym mutacjom (nazwijmy ten szczep "jednorękim bandytą"). Jednocześnie plazmid ten umożliwiałby prezentację tychże białek na powierzchni komórek bakteryjnych gdzie istniałaby możliwość selekcji komórek posiadających białko najsilniej oddziałujące z białkiem wprowadzonym do pożywki. Wyobrażaliśmy sobie że taki układ urządzeń pozwoliłby na znajdowanie przeciwciał o nowych właściwościach czy przeszukiwanie w zupełnie nowy sposób bibliotek sekwencji kodujących różne białka.

"Jednoręki bandyta"

Naszym celem jest zmienianie sekwencji białka tak aby umożliwić jego silniejsze oddziaływanie z partnerem, jednocześnie chcieliśmy zastosować presję selekcyjną tak aby w populacji komórek niosących sekwencję kodującą dane białko przeżywały tylko te które oddziałują najsilniej. Rozwiązaniem pierwszej części problemu jest właśnie szczep "jednoręki bandyta" którego zadaniem byłoby randomizowanie sekwencji kodującej badane białko - tak jak automat do gry losowo ustawiałby nukleotydy. Jak się wydaje najprostszym sposobem byłoby zastosowanie standardowo dostępnych szczepów E. coli z uszkodzonymi właściwościami korekcyjnymi polimeraz DNA lub szczepów z uszkodzonymi systemami naprawy DNA. Wysokie ogólne tło mutacyjne pozwoliłoby na zróżnicowanie naszej sekwencji. Wysoki poziom mutacji w całym genomie może jednak stać się problemem jeśli weźmiemy pod uwagę stosowanie presji selekcyjnej (o jej szczegółach będzie mowa w kolejnym paragrafie). Zamiast korzystnej zmiany poszukiwanej w naszym białku prawdopodobnie moglibyśmy otrzymywać mutanty w sekwencji genomowego DNA z obniżona wrażliwością na presję. Zaczęliśmy więc poszukiwać sposobu aby pojawianie się mutacji ograniczyć jedynie do wybranego fragmentu plazmidu w którym znajdowałaby się sekwencja naszego białka. Jako że na początku projektu skupialiśmy się głównie na idei tworzenia nowych przeciwciał to szybko pojawił się pomysł wykorzystania białka AID (activation-induced deamidase).

Białko to jest aktywne w limfocytach ssaków gdzie umożliwia zachodzenie somatycznych hipermutacji - zwiększenie poziomu mutacji w sekwencjach kodujących przeciwciała tak aby wyselekcjonować linie limfocytów o przeciwciałach o jak najwyższej specyficzności. Co więcej istniała publikacja [ref1] która wskazywała na pewną aktywność tego biała po wprowadzeniu sekwencji go kodującej do komórek E. coli. To jednak też nie było do końca to o co nam chodziło - dalej potrzebny był nam sposób na ograniczenie mutacji do określonego rejonu plazmidu. AID działa preferencyjnie na jednoniciowe DNA pojawiające się w wysoko transkrybowanych rejonach. Najprościej więc byłoby sprawić żeby nasza sekwencja była bardzo wysoko transkrybowana (najsilniej w całej komórce). Idealnym rozwiązaniem wydaje się umieszczenie naszej sekwencji pod kontrolę promotora np. pochodzącego z faga T7 i wprowadzenie do komórki genu kodującego ta polimerazę pod kontrola innego indukowanego promotora. Trzeba jednak pamiętać że wiele istotnych dla przeżycia komórki genów jest także wysoko transkrybowanych i zmiany w ich sekwencji najłatwiej mogą się przyczynić do ograniczenia presji selekcyjnej. Dlatego spróbowaliśmy pójść o krok dalej - stworzyć białko fuzyjne złożone z AID i polimerazy faga T7. Polimeraza T7 przemieszczała by się po fragmęcie DNA znajdującym się za promotorem T7 i "ciągnęła" za sobą AID wprowadzający mutacje w tym rejonie. AID jest małym białkiem, którego najbliższe homologii występują w postaci oligomerów. Informacje na temat występowania samego AIDu w postaci homokompleksów są sprzeczne jednak musieliśmy wziąć taka ewentualność pod uwagę. Dlatego stworzyliśmy układ który zawiera sam AID i AID połączony z polimerazą faga T7. Wyobrażamy sobie że AID-T7 będzie rekrutował do genu znajdującego się pod kontrolą promotora faga T7 wolne cząsteczki AIDu. Reasumując stworzyliśmy cztery różne układy znajdujące się pod kontrola promotora indukowanego arabinozą (plazmid pMPMT5omega):

1. AID

2. AID w fuzji transkrypcyjnej z polimerazą faga T7

3. AID w fuzji translacyjnej z polimerazą faga T7

4. AID w fuzji transkrypcyjnej z fuzją translacyjną AID-T7

Do testowania tych różnych wariantów AIDu trzeba było stworzyć dodatkowo układ reporterowy. W tym celu wykorzystaliśmy alfa komplentujacy fragment beta galaktozydazy znajdujący się pod kontrolą promotora faga T7 umieszczony na plazmidzie jednokopijnym pZC320. Po zaindukowaniu spodziewaliśmy się zobaczyć białe kolonie na szalkach z X-gal tam gdzie nastąpiły mutacje. Jednocześnie konieczne byłoby sprawdzenie poziomu mutacji w cały genomie. Chcieliśmy w tym celu wykorzystać test na pojawienia się spontanicznej oporności na antybiotyk rifampicynę. Doświadczenie wyglądało następująco: w hodowli płynnej przy pomocy arabinozy indukujemy aktywność różnych wariantów AIDu i wysiewamy te hodowle odpowiednio rozcięczone na szalki z X-gal oraz na szalki z rifampicyna i po prostu liczymy kolonie.

Fig. 1. JAKI TU MA BYĆ PODPIS?

Takie były nasze plany do momentu ich zderzenia z rzeczywistością - rzeczywistość jest mocno przereklamowana. Udało się nam uzyskać różna liczbę białych kolonii w różnych konstruktach, ale okazało się że znakomita większość uzyskiwanych białych kolonii mimo ze jest biała to niesie niezmieniony gen kodujący alfa fragment beta galaktozydazy. Wykazało to wadę naszego systemu repoterowego - nikt nie wie dlaczego te kolonie są białe. Testy jak dotąd przeprowadzono na dwóch szczepach: TOP10 i GM, te drugie maja uszkodzony system naprawy oparty o metylazę Dcm, co powinno powodować mniejszy poziom naprawy mutacji powodowanych przez AID. Wstępne uzyskane wyniki z szalek z X-gal oraz szalek z rifampicyną znajda się w tabeli...

Nasze dalsze plany to szybkie stworzenie innego układu reporterowego oraz sprawdzenie naszych konstruktów w innych szczepach z uszkodzonymi systemami naprawy DNA.

Do momentu rozwiązania tych problemów naszym "jednorękim bandyta" będzie któryś z wspomnianych szczepów o podniesionym ogólnym poziomie mutacji - najprawdopodobniej szczep mutD5.

"Myśliwy" i "ofiara"

W poprzednim akapicie opisaliśmy nasze plany zróżnicowania wyjściowych sekwencji kodujących białko (nazwijmy je "myśliwym"), teraz nadszedł moment na opisanie jak będziemy przeszukiwać tak wytworzona pulę "myśliwych". Na pierwszy rzut oka najlepszym rozwiązaniem byłoby zastosowanie czegoś bardzo podobnego do testu dwuhybrydowego. Jednak tak nie jest gdyż wymagałoby to umieszczenia obu sekwencji ("myśliwego" i "ofiary") w tej samej komórce "jednorękiego bandyty" - zawsze istniałoby niebezpieczeństwo zmiany obu sekwencji, a nie tylko jednej z nich. Tak więc białko "ofiary" musi być w jakiś sposób dostarczane z zewnątrz i umożliwiać przeżycie tylko tych komórek które niosą najlepszych "myśliwych".

Podstawą jest to aby"myśliwy" był obecny na powierzchni komórki E. coli dlatego wszystkie konstrukty je zawierające posiadają także fragment białka błony zewnętrznej -OmpA. W ten sposób "myśliwy" jest prezentowany na powierzchni komórki i ma kontakt z płynna pożywką do której dodawane jest białko "ofiara".

Fig. 3. PODPIS

To jednak jeszcze nie zapewnia przeżycia jedynie najlepszym "myśliwym". Konieczne jest zastosowanie odpowiedniej presji selekcyjnej tak aby przeżyli jedynie "najlepiej przystosowani". Skorzystaliśmy tutaj z możliwości podzielenia TEM-1 beta laktamazy (białka dającego oporność na niektóre antybiotyki beta-laktamowe m. in. ampicylinę) na dwa komplementujące fragmenty: alfa i omega. Fragmenty te nie łączą się spontanicznie, chyba że znajdą się przez pewien czas w bardzo niewielkiej odległości- dzieje się tak gdy są one połączone z oddziaływującymi silnie ze sobą białkami. Po połączeniu fragmentów odtwarzany jest aktywny enzym, który daje pewną oporność na ampicylinę znajdującą się w pożywce. Tak więc "myśliwy" połączony z jednym z fragmentów beta laktamazy, który będzie najwydajniej chwytał "ofiary" połączone z drugim fragmentem beta laktamazy zapewni przeżycie komórce go niosącej. Stopniowo ta linia będzie uzyskiwała przewagę w hodowli aż do kolejnej mutacji polepszającej właściwości "myśliwego".

Na początku trzeba było potwierdzić działanie sytemu i znaleźć najbardziej optymalna konfigurację fragmentów beta laktamazy. W tym celu wybraliśmy parę niewielkich białek o potwierdzonych i silnych oddziaływaniach: białko A i białko Z. Białko A jest tym słynnym białkiem S. aureus wiążącym fragmenty stałe przeciwciał IgG i mającym liczne zastosowania w biologii molekularnej. Białko Z jest jego bliskim krewnym stworzonym sztucznie [ref 2] i silnie oddziałującym zarówno z swoim krewnym jak i tworzącym homooligomery (oddziaływanie to jest jednak znacznie słabsze niż oddziaływanie z białkiem A). Stworzyliśmy cała pule konstruktów opartych o plazmid pACYC177 (niskokopijny: ok. 10 kopi na komórkę) ze wstawionym promotorem indukowanym IPTG. Zawierają one fragment białka OmpA, białko A i Z oraz fragmenty alfa i omega beta-laktamzy w różnych kombinacjach. Białko A składa się z dwóch niemal idealnych powtórzeń (każde z nich może niezależnie oddziaływać z białkiem Z), część konstruktów zawiera skrócona wersję biała A (A delta), która oddziałuje z białkiem Z. Konstrukty na pACYC177:

1. OmpA_alfa

2. OmpA_omega

3. OmpA_A_alfa

4. OmpA_Z_alfa

5. OmpA_A_omega

6. OmpA_Z_omega

7. OmpA_omega_Adelta_alfa

8. OmpA_omega_Adelta

9. OmpA_Adelta_alfa

10. OmpA_Adelta_omega

Równolegle z ich testowaniem, trwają prace nad stworzeniem kolejnych konstruktów z tej grupy.

Drugą grupę konstruktów stanowią te służące do nadprodukcji i oczyszczania białka dodawanego następnie do pożywki. Te które powstały do tej pory znajdują się na plazmidzie pET15b i posiadają N-końcowy His-tag:

1. His_Z_omega

2. His_Z_alfa

3. His_A_alfa

4. W przypadku dwóch pierwszych udało się przeprowadzić nadprodukcje i oczyszczenie białka. Użycie His-taga okazało się niepotrzebne gdyż agregat białka Z znajduje się w osadzie po sonikacji (ponad 90% osadu). Prace nad kolejnymi konstruktami trwają, jednak już do tej pory udało się uzyskać kilka ciekawych wyników. Tabela i jej wyjaśnienie.

Naszym długoterminowym celem jest zastąpienie białka A i Z fragmentem przeciwciała (lub ich biblioteką) oraz antygenem. Jednak na krótka metą musimy jeszcze sprawdzić czy to w ogóle będzie działać. Dlatego do sekwencji białek A wprowadzimy mutacje uniemożliwiające oddziaływanie z bialkiem Z a uzyskane konstrukty transformujemy do "jednorękiego bandyty" - chcemy zobaczyć czy i jak szybko w mieszaninie mutantów nastąpi powrót do prawidłowych właściwości białka. Najprostszy wariant tego doświadczenia polegający na mieszaniu istniejących już szczepów, izolacji plazmidu i ocenie proporcji komórek różnych szczepów przy pomocy trawienia restrykcyjnego dały bardzo zachęcające wyniki. Po zmieszaniu w równym stosunku szczepów niosących OmpA_alfa i OmpA_A_alfa, a następnie zastosowaniu naszego systemu selekcji wyizolowaliśmy z wyrosłych bakterii jedynie plazmid niosący OmpA_A_alfa (analogiczne doświadczenie udało się dla zmieszanych szczepów OmpA_omega i OmpA_A_omega).

Kolejne wyniki i powstające konstrukty będą wprowadzane w czasie rzeczywistym ;) zostańcie na bieżąco..