Team:Chiba/Project/j

From 2008.igem.org

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== '''イントロ''' ==
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より詳しいプロジェクト内容は[[Team:Chiba/Project|こちらのページ]]に英語で記載されています。
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クオラムセンシングを利用して、入力がぞんざいした'''時間'''を測る。すなわち、タイマーを作成する。
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クオラムセンシングを利用することにより、シグナル分子の蓄積を時間に換算することができ、かつ、それを読み出すことができる。
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私たちは、クオラムセンシングの時間スケールを変更することによって、いくつかのタイマーを作成することを目標とする。
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=='''時間スイッチ'''==
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==アブストラクト==
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'''クオラムセンシング'''による細胞間コミュニケーションを利用する。
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delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。
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-->*なぜクオラムセンシングを使うのか<Br>蓄積したもの(->時間に換算する)を読み出して、出力に結び付けることができるから。
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Y.pseudotuberculosisとP. aeruginosaでは、AHLsは、対数増殖期には蓄積するが、ステイショナリーフェイズでは大部分が消失してしまうという報告あり（培養液中）([[Team:Chiba/Reference/j|ref.8]])。
 
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=='''プロジェクトデザイン'''==
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[[Image:Chiba fig3 2.png|right|frame|'''Fig. 3　System design''']]
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[http://en.wikipedia.org/wiki/Water_clock 水時計(wikipedia.en)　]のような働きをする大腸菌をデザインした。Fig.3にその機構を示す。
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発現時間の調節をするために、以下の要件が挙げられる。
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1. センダーは、シグナル分子を'''ゆっくりと一定の速度で'''合成する。シグナル分子は代謝されない(あるいは現実的な時間スケールであれば事実上代謝されない)ために、ゆっくりと時間をかけて(線形に)蓄積される。
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#インデューサーの合成速度を下げる。<Br>RBSの調整(B0030-->B0033),コピー数の調整(5-->300)
 
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#レセプタータンパク質の感度を下げる。<Br>クオラムセンシングのクロストークを利用する。生物によってAHL(Acyl-L-Homoserine Lactone)のアシル基が異なる([[Team:Chiba/Reference/j|ref.3]])。
 
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*ex)(  )内はシンターゼ
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2. レシーバーはシグナル分子の濃度が閾値に達したときに初めて、シグナル分子を感知し遺伝子スイッチを''オン''にする。異なるシグナル分子の場合、遺伝子スイッチは異なる速度で活性化される。システム全体は'''順番を持って起動するスイッチ'''として働く。
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**P.aeruginosa->C4-AHL(RhlI)
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**V. fisheri->C6-3-oxo-AHL(LuxI)
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**A.tumefaciens->C8-3-oxo-AHL(TraI)
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**P.aeruginosa->C10-3-oxo-AHL(VanI)
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**P.aeruginosa->C12-3-oxo-AHL(LasI)
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**R.leguminosarum->C14-3-hydroxy-AHL(CinI)
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'''Construction'''(From BioBrick)
 
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:*Sender(Autoinducer synthase)
 
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::LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
 
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:*Receiver
 
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::LuxR,LasR,CinR,RhlR
 
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'''Cross-Talk Check'''
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3.レシーバーの感度を変える、またはシグナル分子の蓄積速度を変えることで、スイッチの遅延時間を変えることができる。いくつかの遅延時間を持ったスイッチを使うことで、異なる多数の細胞機能を、順番に活性化することができる.
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#LuxR vs LuxI('''OK'''),LasI('''OK'''),CinI(?),RhlI('''OK''')
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#LuxI vs LuxR,LasR,CinR,RhlR
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'''RBS交換'''<Br>
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===シグナリングシステム===
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*既存のパーツ
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本プロジェクトでは、シグナル分子としてアシルホモセリンラクトン（AHL）使用する。センダーは、LuxIあるいは類似の酵素を常時発現する。これら酵素はAHLsの合成を触媒する。すべての細胞はおおよそ一定の速度でAHLを合成する。AHLは細胞膜を透過し、近傍の細胞に感知される。レシーバーはLuxRタンパク質あるいは類似のタンパク質を常時発現する。AHLはLuxRタンパク質と結合し、AHL-LuxR複合体を形成する。この複合体は、Luxプロモーターを活性化する。LuxプロモーターがONになるAHL濃度は、AHLと個々のLuxRタンパク質との親和性により決定される。[[Team:Chiba/Project#References|<sup>(3),(4)</sup>]].
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**Boo34+luxI<Br>
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[[Team:Chiba/about_qs|(more about quorum sensing)]]
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*New parts(planning)
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**Boo33(weak)+luxI
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**Boo32(medium)+luxI
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**Boo31(weaker)+luxI
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'''More about Quorum Sensing'''<Br>
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<br clear=all>
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*[http://parts.mit.edu/registry/index.php/Featured_Parts:Cell-Cell-Signaling Cell-Cell-Signaling]<Br>
+
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*[http://www.che.caltech.edu/groups/fha/quorum.html About Quorum sensing]
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=='''入力'''==
 
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=='''出力'''==
 
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=== 遅延スイッチの作製 ===
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3つの方法がある。
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#シグナル分子の蓄積速度を低下させる
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#レシーバーの感度を低下させる
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#シグナル分子を一部分解する
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'''異種間コミュニケーション!'''
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==実験リスト==
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[[Image:Chiba Igem 1.png|130px|'''Fig.4''' Chiba project design.jpg]]
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[[Image:Chiba Igem 2.png|172px|'''Fig.5''' ]]
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[[Image:Chiba Igem 3.png|172px|'''Fig.6''' LuxR mutant]]
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[[Image:Chiba Igem 4.png|130px|'''Fig.7''' ]]
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[[Image:Chiba Igem 5.png|130px|'''Fig.8''' ]]
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| align="center"| '''[[Team:Chiba/Project/Experiments:Signal Molecule Quencher/j|実験 #1 シグナル分子の部分的な分解]]'''
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| align="center"| '''[[Team:Chiba/Experiments:copy number/j|実験 #2 バランシングプレーヤー]]'''
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| align="center"| '''[[Team:Chiba/Experiments:LuxR_mutant/j|実験 #3 Lux変異体]]'''
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| align="center"| '''[[Team:Chiba/Project/Experiments:Sender_Crosstalk/j|Exp #4 外国人-->日本人]]'''
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| align="center"| '''[[Team:Chiba/Project/Experiments:Receiver_Crosstalk/j|Exp #5 日本人-->外国人]]'''
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*'''Others'''
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**'''[[Team:Chiba/Experiments:Reporter|レポーター]]'''
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**'''[[Team:Chiba/Demo_experiments|デモンストレーション]]'''
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==コンクルージョン==
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!align="center"|[[Team:Chiba/j|ホーム]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
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Latest revision as of 12:22, 15 December 2008

Chiba-U.gif
ホーム メンバー紹介 プロジェクト紹介 作成したDNAパーツ ノート

より詳しいプロジェクト内容はこちらのページに英語で記載されています。

Contents

アブストラクト

delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。


プロジェクトデザイン

Fig. 3　System design

[http://en.wikipedia.org/wiki/Water_clock 水時計(wikipedia.en)　]のような働きをする大腸菌をデザインした。Fig.3にその機構を示す。

1. センダーは、シグナル分子をゆっくりと一定の速度で合成する。シグナル分子は代謝されない(あるいは現実的な時間スケールであれば事実上代謝されない)ために、ゆっくりと時間をかけて(線形に)蓄積される。


2. レシーバーはシグナル分子の濃度が閾値に達したときに初めて、シグナル分子を感知し遺伝子スイッチをオンにする。異なるシグナル分子の場合、遺伝子スイッチは異なる速度で活性化される。システム全体は順番を持って起動するスイッチとして働く。


3.レシーバーの感度を変える、またはシグナル分子の蓄積速度を変えることで、スイッチの遅延時間を変えることができる。いくつかの遅延時間を持ったスイッチを使うことで、異なる多数の細胞機能を、順番に活性化することができる.

シグナリングシステム

本プロジェクトでは、シグナル分子としてアシルホモセリンラクトン（AHL）使用する。センダーは、LuxIあるいは類似の酵素を常時発現する。これら酵素はAHLsの合成を触媒する。すべての細胞はおおよそ一定の速度でAHLを合成する。AHLは細胞膜を透過し、近傍の細胞に感知される。レシーバーはLuxRタンパク質あるいは類似のタンパク質を常時発現する。AHLはLuxRタンパク質と結合し、AHL-LuxR複合体を形成する。この複合体は、Luxプロモーターを活性化する。LuxプロモーターがONになるAHL濃度は、AHLと個々のLuxRタンパク質との親和性により決定される。(3),(4). (more about quorum sensing)



遅延スイッチの作製

3つの方法がある。

  1. シグナル分子の蓄積速度を低下させる
  2. レシーバーの感度を低下させる
  3. シグナル分子を一部分解する


異種間コミュニケーション!

実験リスト

Fig.4 Chiba project design.jpg

Fig.5

Fig.6 LuxR mutant

Fig.7

Fig.8

実験 #1 シグナル分子の部分的な分解 実験 #2 バランシングプレーヤー 実験 #3 Lux変異体 Exp #4 外国人-->日本人 Exp #5 日本人-->外国人


コンクルージョン

ホーム メンバー紹介 プロジェクト紹介 作成したDNAパーツ ノート 謝辞
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