Team:Chiba/Project/j

From 2008.igem.org

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(→Controlling the Delay time of the AHL signaling)
(→How Our System Works)
 
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<html><link rel="stylesheet" href="https://2008.igem.org/wiki/index.php?title=User:Maiko/chiba.css&action=raw&ctype=text/css" type="text/css" /></html>
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[[Image:Chiba-U.gif|center]]
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!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
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より詳しいプロジェクト内容は[[Team:Chiba/Project|こちらのページ]]に英語で記載されています。
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=='''ゴール'''==
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==アブストラクト==
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'''クオラムセンシング'''による細胞間コミュニケーションを利用して、入力が存在した'''時間'''を測る。すなわち、タイマーを作成する。クオラムセンシングを利用することにより、シグナル分子の蓄積を時間に換算することができ、かつ、それを読み出すことができる。クオラムセンシングの時間スケールを変更することによって、いくつかのタイマーを作成することを目標とする。
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delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。
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===description案1===
 
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私たちのプロジェクトはE.coli Time Managerを作ることです。
 
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　これは，遺伝子発現のタイミングをお好みの時間に設定できるシステムです。例えば，このTime Managerを使うと，研究者の望みの時間になったら目的の遺伝子発現が開始するようにできます。これで研究者達の実験による時間拘束のストレスを解消できるのです！！！
 
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　本システムでは，通信分子であるAHLの濃度依存的に遺伝子発現の起こるクオラムセンシングを応用します。AHLには，アシル基の違いによりさまざまな種類があります。AHL Receiverは整合するペアとなるAHLと似通った構造のAHLを誤認し，クロストークを起こします。クロストークが起こった場合は，AHLの構造の違いにより，Receiverが認識しにくくなり，下流の遺伝子発現までのAHL濃度の閾値が高くなります。つまり,AHL Reciverと整合するペアとなるAHLと，それとはアシル基の違うAHLを同じ速度で合成した場合とでは，下流の遺伝子発現までにTime Delayが生じると考えました。Time Delayを作り出すことによって，遺伝子発現までの時間を調節しTime manegementを目指します。そこで，様々なTime Delayを作り出すためにAHL SenderとAHL Receiverの組み合わせを変えることを考えています。
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=='''プロジェクトデザイン'''==
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===description案2===
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[[Image:Chiba fig3 2.png|right|frame|'''Fig. 3　System design''']]
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タイトル：E.coli Timing Manager
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（１）デジタル回路においては、沢山のスイッチが次々に、そして任意の順番とDelay timeをもって自動起動します。たとえば、データの保存をしたい時であれば、データの出力とデータ保持のスイッチが、適切なタイミングでONになっていなければなりません。遺伝子回路に複雑な仕事をするためには、デジタル回路と同様に、遺伝子が、任意の順番で、かつDelay-timeをもって発現する仕組みを作成しなければなりません。
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[http://en.wikipedia.org/wiki/Water_clock 水時計(wikipedia.en)　]のような働きをする大腸菌をデザインした。Fig.3にその機構を示す。
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（２）私たちは、この仕組みを実現するデバイス、E.coli Timing Managerの作成を目指します。
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1. センダーは、シグナル分子を'''ゆっくりと一定の速度で'''合成する。シグナル分子は代謝されない(あるいは現実的な時間スケールであれば事実上代謝されない)ために、ゆっくりと時間をかけて(線形に)蓄積される。
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（３，４）任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、私たちは、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用します。クオラムセンシングにおいては、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこります。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動します。
 
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（５）つまり、遺伝子発現が、感度の違いによる順番とDelay-timeを伴って起こるという仕組みが実現されるのです。
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2. レシーバーはシグナル分子の濃度が閾値に達したときに初めて、シグナル分子を感知し遺伝子スイッチを''オン''にする。異なるシグナル分子の場合、遺伝子スイッチは異なる速度で活性化される。システム全体は'''順番を持って起動するスイッチ'''として働く。
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==プロジェクトデザイン==
 
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*クオラムセンシング
 
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特定の入力に曝されたバクテリアは、シグナル分子（AHL:N-Acyl-L-homoserine Lactone）を合成する。シグナル分子が閾値を超えると、レポータータンパク質が発現。入力にさらされていた時間を知らせる、タイマーとなる。
 
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===感度差による応答時間の差===
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3.レシーバーの感度を変える、またはシグナル分子の蓄積速度を変えることで、スイッチの遅延時間を変えることができる。いくつかの遅延時間を持ったスイッチを使うことで、異なる多数の細胞機能を、順番に活性化することができる.
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任意の順番と、delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。
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=== Controlling the Delay time of the AHL signaling ===
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===シグナリングシステム===
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LuxIのつくるAHLに対して、感度差による応答時間差は、２つの方法で実現することができる。
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本プロジェクトでは、シグナル分子としてアシルホモセリンラクトン（AHL）使用する。センダーは、LuxIあるいは類似の酵素を常時発現する。これら酵素はAHLsの合成を触媒する。すべての細胞はおおよそ一定の速度でAHLを合成する。AHLは細胞膜を透過し、近傍の細胞に感知される。レシーバーはLuxRタンパク質あるいは類似のタンパク質を常時発現する。AHLはLuxRタンパク質と結合し、AHL-LuxR複合体を形成する。この複合体は、Luxプロモーターを活性化する。LuxプロモーターがONになるAHL濃度は、AHLと個々のLuxRタンパク質との親和性により決定される。[[Team:Chiba/Project#References|<sup>(3),(4)</sup>]].
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#LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる<br>LuxRの変異体を用いれば、pluxがonになるAHL濃度が<1nMから~10nMまで変化する。[http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.''et al''.Mol.Microbiol.2005.'''55'''(3).712–723]
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[[Team:Chiba/about_qs|(more about quorum sensing)]]
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#クロストークを使う（その１）<br>AHL=Acyl-homoserine Lactoneには、そのアシル基が異なる種類がある。luxIが合成するAHLは、3-oxo-hyxanoyl-Homoserine Lactone (=OHHL)であり、3-oxo-dodecanoyl-homoserine Lactone(=ODHL)や、butyryl-homoserine Lactone(=HHL)が存在する。それぞれ、合成酵素はLasI、RhlI（ともにシュードモナス由来）と呼ばれる。このほかのAHL分子と、その合成酵素を以下に示した。これらのAHL分子は、アシル基のみが異なるため、一定の割合でLuxRと相互作用する（cross-talkする）。たとえば、OdHLとLuxRとのcross-talk（LasI-LuxR）は、OHHLとLuxRの場合（LuxI-LuxR）の1/20である。AHL分子の蓄積速度が一定ならば，luxI-LuxR/Pluxよりも20倍遅くスイッチが入ることとなる。
+
-
#クロストーク（その２）-LuxR/ Pluxの感度変異体を用いる場合-<br>LuxRの変異体を作成すれば、3OC6HSL以外のAHLs(C10HSL, C6HSL, C8HSL, C12HSL,3OC12HSL)でもactiveとなる。[http://www.nature.com/nbt/journal/v24/n6/abs/nbt1209.html C. H. Collins. ''et al''.Nature Biotechnology.'''24''', 708 - 712 (2006)]<br>Fig.2(wild-type LuxR,LuxR-G2E,LuxR-G2E-R67MのAHLs感受性を評価したグラフ)参照。LuxR変異体(LuxR-G2E,LuxR-G2E-R67M)を作成しており、これらは3OC6HSL, C10HSL, C6HSL, C8HSL, C12HSL,3OC12HSLによってactiveとなる。
+
-
====クオラムセンシングのクロストーク====
+
<br clear=all>
-
生物によってAHL(Acyl-L-Homoserine Lactone)のアシル基が異なる([[Team:Chiba/Reference/j|ref.3]]).<Br>生物ごとのクオラムセンシングについては、[[Team:Chiba/Reference/j|ref.9]]参照.
+
-
<table width="500" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000" center>
+
=== 遅延スイッチの作製 ===
-
<tr>
+
3つの方法がある。
-
<td width="200">Strain</td>
+
#シグナル分子の蓄積速度を低下させる
-
<td width="200">Signal Molecule</td>
+
#レシーバーの感度を低下させる
-
<td width="150">Enzyme<td>
+
#シグナル分子を一部分解する
-
</tr>
+
-
<tr>
+
-
<td>P.aeruginosa</td>
+
-
<td>C4-HSL</td>
+
-
<td>RhlI</td>
+
-
</tr>
+
-
<tr>
+
-
<td>V. fisheri</td>
+
-
<td>C6-3-oxo-HSL</td>
+
-
<td>LuxI</td>
+
-
</tr>
+
-
<tr>
+
-
<td>A.tumefaciens</td>
+
-
<td>C8-3-oxo-HSL</td>
+
-
<td>TraI</td>
+
-
</tr>
+
-
<tr>
+
-
<td>P.aeruginosa</td>
+
-
<td>C10-3-oxo-HSL</td>
+
-
<td>VanI</td>
+
-
</tr>
+
-
<tr>
 
-
<td>P.aeruginosa</td>
 
-
<td>C12-3-oxo-HSL</td>
 
-
<td>LasI</td>
 
-
</tr>
 
-
<tr>
+
'''異種間コミュニケーション!'''
-
<td>R.leguminosarum</td>
+
==実験リスト==
-
<td>C14-3-hydroxy-HSL</td>
+
-
<td>CinI</td>
+
-
</tr>
+
-
</table>
+
-
'''Construction'''(From BioBrick)
+
<center>
-
:*Sender(Autoinducer synthase)
+
{| style="border:0px;" cellpadding="0px" |
-
::LuxI,LasI,CinI,RhlI(lacプロモーター)
+
|-
-
:*Receiver
+
| valign="center" align="center" width="20%"|
-
::LuxR,LasR,CinR,RhlR
+
[[Image:Chiba Igem 1.png|130px|'''Fig.4''' Chiba project design.jpg]]
 +
| valign="center" align="center" width="20%"|
 +
[[Image:Chiba Igem 2.png|172px|'''Fig.5''' ]]
 +
| valign="center" align="center" width="20%"|
 +
[[Image:Chiba Igem 3.png|172px|'''Fig.6''' LuxR mutant]]
 +
| valign="center" align="center" width="20%"|
 +
[[Image:Chiba Igem 4.png|130px|'''Fig.7''' ]]
 +
| valign="center" align="center" width="20%"|
 +
[[Image:Chiba Igem 5.png|130px|'''Fig.8''' ]]
-
'''More about Quorum Sensing'''<Br>
+
|-
-
*[http://parts.mit.edu/registry/index.php/Featured_Parts:Cell-Cell-Signaling Cell-Cell-Signaling]<Br>
+
| align="center"| '''[[Team:Chiba/Project/Experiments:Signal Molecule Quencher/j|実験 #1 シグナル分子の部分的な分解]]'''
-
*[http://www.che.caltech.edu/groups/fha/quorum.html About Quorum sensing]
+
| align="center"| '''[[Team:Chiba/Experiments:copy number/j|実験 #2 バランシングプレーヤー]]'''
 +
| align="center"| '''[[Team:Chiba/Experiments:LuxR_mutant/j|実験 #3 Lux変異体]]'''
 +
| align="center"| '''[[Team:Chiba/Project/Experiments:Sender_Crosstalk/j|Exp #4 外国人-->日本人]]'''
 +
| align="center"| '''[[Team:Chiba/Project/Experiments:Receiver_Crosstalk/j|Exp #5 日本人-->外国人]]'''
 +
 
 +
|}
 +
</center>
 +
 
 +
 
 +
*'''Others'''
 +
**'''[[Team:Chiba/Experiments:Reporter|レポーター]]'''
 +
**'''[[Team:Chiba/Demo_experiments|デモンストレーション]]'''
 +
 
 +
==コンクルージョン==
-
{| style="color:white;background-color:Maroon" cellpadding="3" cellspacing="3" border="1" bordercolor="white" width="100%" align="center"
+
{| style="color:white;" cellpadding="3" cellspacing="3" border="0" width="100%" align="center" class="menu" |
!align="center"|[[Team:Chiba/j|ホーム]]
!align="center"|[[Team:Chiba/j|ホーム]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Team/j|メンバー紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Project/j|プロジェクト紹介]]
-
!align="center"|[[Team:Chiba/Parts/j|Parts Submitted to the Registry]]
+
!align="center"|[[Team:Chiba/Parts/j|作成したDNAパーツ]]
-
!align="center"|[[Team:Chiba/Modeling/j|モデリング]]
+
!align="center"|[[Team:Chiba/Internal|ノート]]
!align="center"|[[Team:Chiba/Internal|ノート]]
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!align="center"|[[Team:Chiba/Acknowledgements|謝辞]]
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Latest revision as of 12:22, 15 December 2008

Chiba-U.gif
ホーム メンバー紹介 プロジェクト紹介 作成したDNAパーツ ノート

より詳しいプロジェクト内容はこちらのページに英語で記載されています。

Contents

アブストラクト

delay-timeをもった遺伝子発現を実現するために、バクテリア間の細胞間通信、クオラムセンシングを利用する。クオラムセンシングでは、応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる。AHL情報がじゅうぶんゆっくり蓄積するとき、ひとつのAHL送信装置に対して、感度の異なる複数の受信装置によってさまざまな出力装置を独立に起動すれば、感度の高いAHL 受信機ほど先に起動する。


プロジェクトデザイン

Fig. 3　System design

[http://en.wikipedia.org/wiki/Water_clock 水時計(wikipedia.en)　]のような働きをする大腸菌をデザインした。Fig.3にその機構を示す。

1. センダーは、シグナル分子をゆっくりと一定の速度で合成する。シグナル分子は代謝されない(あるいは現実的な時間スケールであれば事実上代謝されない)ために、ゆっくりと時間をかけて(線形に)蓄積される。


2. レシーバーはシグナル分子の濃度が閾値に達したときに初めて、シグナル分子を感知し遺伝子スイッチをオンにする。異なるシグナル分子の場合、遺伝子スイッチは異なる速度で活性化される。システム全体は順番を持って起動するスイッチとして働く。


3.レシーバーの感度を変える、またはシグナル分子の蓄積速度を変えることで、スイッチの遅延時間を変えることができる。いくつかの遅延時間を持ったスイッチを使うことで、異なる多数の細胞機能を、順番に活性化することができる.

シグナリングシステム

本プロジェクトでは、シグナル分子としてアシルホモセリンラクトン（AHL）使用する。センダーは、LuxIあるいは類似の酵素を常時発現する。これら酵素はAHLsの合成を触媒する。すべての細胞はおおよそ一定の速度でAHLを合成する。AHLは細胞膜を透過し、近傍の細胞に感知される。レシーバーはLuxRタンパク質あるいは類似のタンパク質を常時発現する。AHLはLuxRタンパク質と結合し、AHL-LuxR複合体を形成する。この複合体は、Luxプロモーターを活性化する。LuxプロモーターがONになるAHL濃度は、AHLと個々のLuxRタンパク質との親和性により決定される。(3),(4). (more about quorum sensing)



遅延スイッチの作製

3つの方法がある。

  1. シグナル分子の蓄積速度を低下させる
  2. レシーバーの感度を低下させる
  3. シグナル分子を一部分解する


異種間コミュニケーション!

実験リスト

Fig.4 Chiba project design.jpg

Fig.5

Fig.6 LuxR mutant

Fig.7

Fig.8

実験 #1 シグナル分子の部分的な分解 実験 #2 バランシングプレーヤー 実験 #3 Lux変異体 Exp #4 外国人-->日本人 Exp #5 日本人-->外国人


コンクルージョン

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