Team:Chiba/jk/α

From 2008.igem.org

(Difference between revisions)

Revision as of 02:50, 21 September 2008

入力班のぺーじ。

2008.8.20

PCR:PCR
・BBa_J22136(2007)①
・BBa_J22136(2008)②
・BBa_J22141(2007)③
・BBa_J22141(2008)④
・BBa_E0612(2008)⑤

>

Sample No	①	②	③	④	⑤
DNA tamplate	1	1	1	1	1
FW primer	5	5	5	5	5
VR primer	5	5	5	5	5
dNTPmix	10	10	10	10	10
thermo pol buffer	10	10	10	10	10
DNA pol(VENT)	1	1	1	1	1
dH2O	68	68	68	68	68
TOTAL	100	100	100	100	100

→gel check:Gel Check

>

Sample No	①	②	③	④	⑤
Sample DNA	1	1	1	1	1
loading dye	1	1	1	1	1
dH₂O	4	4	4	4	4
Total	6	6	6	6	6

→どれもバンド出ず。

trnsformation:Transformation

・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)

→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(１個のみ)

2008.8.21

8.20にtransformationしたもの
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007) を２ml培養、12h。ただしコロニーが１個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、さらに1h培養した。

2008.8.22

mini prep:Mini Prep
2ml培養した
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
をミニプレした。

insert check:Digestion

BBa_J06650(2006)
BBa_J06650(2007)
BBa_J22136(2007)
BBa_J22141(2007)
BBa_R0051(2006)
BBa_R0051(2007)
BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。

混ぜ表

	double	simgle
dH₂O	14	25
10×BSA	7	10
10×NE	7	10
EcoRI	3.5	5
PstI	3.5	-

2008.8.25

BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり

プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。

OD=0.495培養液	0.67μl
60%グリセロール	0.33μl
20%グリセロールストック(計)	1.00ml

2008.8.28

transformation:Transformation
BBa_I7106(2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してmini prep(60mlで溶出):mini Prep
→Digestion:Digestion
混ぜ表

	double
dH₂O	2
10×BSA	1
10×NE	1
EcoRI	0.5
PstI	0.5
DNA	5
TOTAL	10

Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl

PCR:PCR
RBS＋CI
混ぜ表


DNA	1
FW primer	2.5
VR primer	2.5
dNTPmix	5
thermo pol buffer	5
DNA pol(VENT)	1
dH2O	34
TOTAL	50

ゲルチェック:Gel Check

PCR産物	1
Dye	1
dH₂O	4
TOTAL	6

→濃度は33.6ng/μg

ベクターのPCR:PCR
BBa_I7106
混ぜ表


DNA	1
FW primer	5
VR primer	5
dNTPmix	10
thermo pol buffer	10
DNA pol(VENT)	1
dH2O	68
TOTAL	100

ゲルチェック:Gel Check

PCR産物	1
Dye	1
dH₂O	4
TOTAL	6

→バンド出ず。

2008.8.30

Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

	double
dH₂O	6
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
XbaI	2
DNA	33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL	60

→30μlゲル抽出
→ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

	double
dH₂O	4
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
SpeI	4
DNA	75ng/μl×30μl(2μg)
TOTAL	60

→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
→SAP:SAP
混ぜ表


dH₂O	9
DNA	10
SAP	1
SAP Buffer	10
TOTAL	30

5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Ligation:Ligation
混ぜ表

		b.g
dH₂O	1.4	8
Ligase	1	1
Ligase Buffer	2	2
Vector	1.8	1
Insert	3	-
TOTAL	10	10

→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)

コロニーPCR(16コつつく):ColonyPCR
混ぜ表


VF	2
VFR	2
dNTP	2
thermo pol buffer	2
Tag	0.3
dH2O	11.7
TOTAL	20

→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
→mini prep:Mini Prep

Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

	double
dH₂O	6
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
XbaI	2
DNA	33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL	60

ゲル抽出:Gel Extraction
混ぜ表


Digestion産物	30
Dye	6
TOTAL	36

→Zymo:Zymo
→NFW5μlで溶出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表


dH₂O	4
DNA	1
Dye	1
TOTAL	6

→ゲルチェックOK

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

	double
dH₂O	4
10×BSA	10
10×NE	10
PstI	2
SpeI	4
DNA	75ng/μl×30μl(2.25μg)
TOTAL	60

ゲル抽出:Gel Extraction
混ぜ表


Digestion産物	30
Dye	6
TOTAL	36

→Zymo:Zymo
→NFW10μlで溶出

→SAP:SAP
混ぜ表


dH₂O	9
DNA	10
SAP	1
SAP Buffer(×10)	10
TOTAL	30

→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
→Zymo:Zymo →NFW5μlで抽出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表


dH₂O	4
DNA	1
Dye	1
TOTAL	6

→ゲルチェックOK

Ligation:Ligation
混ぜ表

		b.g
dH₂O	1.4	8
Ligase	1	1
Ligase Buffer	2	2
Vector	1.8	1
Insert	3	-
TOTAL	10	10

→25℃で2h放置 →Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)

2008.9.1

・Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
結果→GFPが発現していた。
→-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。

-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check

混ぜ表

</tr>

	Double	Single
dH₂O	1	2
XbaI	1	1
SpeI	1	-
BSA(×10)	1	1
NEB(×10)	1	1
DNA	5	5
TOTAL	10	10

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@@ Line 747: / Line 747: @@
 <BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
+<BR>混ぜ表
+<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
+<td width="257"></td>
+<td>Double</td><td>Single</td>
+<tr>
+<td>dH<sub>2</sub>O</td>
+<td>1</td><td>2</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>XbaI</td>
+<td>1</td><td>1</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>SpeI</td>
+<td>1</td><td>-</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>BSA(×10)</td>
+<td>1</td><td>1</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>NEB(×10)</td>
+<td>1</td><td>1</td>
+</tr>
+<tr>
+<tr>
+<td>DNA</td>
+<td>5</td><td>5</td>
+</tr>
+<td>TOTAL</td>
+<td>10</td><td>10</td>
+</tr>
+</table>