Team:Chiba/notebook/input/september

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2008.9.1

Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
結果-->GFPが発現していた。-->-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check

混ぜ表

	Double	Single
dH₂O	1	2
XbaI	1	1
SpeI	1	-
BSA(×10)	1	1
NEB(×10)	1	1
DNA	5	5
TOTAL	10	10

UV照射テスト

-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
10⁴,10⁵希釈し、20μlをプレートに撒いた。
37℃,12h後にコロニーを数える。

コロニー数

	UV+ 10⁴	UV+ 10⁵	UV-10⁴	UV-10⁵
0min	423	74	271	156
10min	301	51	-	-
30min	139	7	-	-
1h	89	5	1040	54
2h	5	1	-	-
4h	2	0	254	50
6h	0	0	-	-
8h	1	0	1155	106

2008.9.2

UV照射実験

Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
37℃,12h後,ODを測定して10²~10³のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。

結果

PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。

2008.9.12

Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト

I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養。

37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。

L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。

混ぜ表

	20%L-アラビノース	濃度
①	0μl	0%(N.C)
②	1.9μl	0.2%
③	19μl	2%
④	190μl	20%
⑤	-	P.C

L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。

結果は以下のとおり。

	①	②	③	④	⑤
L-アラビノース入れて30分後	8.890	9.752	10.10	9.413	9.701
L-アラビノース入れて1h後	9.161	13.93	17.37	14.97	10.60
L-アラビノース入れて2h後	9.417	27.96	40.25	29.87	10.72
L-アラビノース入れて6h後	9.933	74.99	150.9	125.0	10.04
L-アラビノース入れて12h後	10.64	99.39	202.88	72.08	11.76
L-アラビノース入れて24h後	14.66	105.6	447.3	33.31	17.11

2008.9.13

Time Delay Test ①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)

②Plac-RhlI -Amp(BW)

③Plac-LasI -Amp(BW)

④Ptet-LuxI -Amp(BW)

プレ培

①LB-Kan 2ml培養

②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養

④LB-Amp　2ml培養

↓over night

本培

50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。

50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。

50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。

OD>2となったらWash

①に関して

①

↓冷却遠心(3700rpm,3min)　　　　　　　　　　

上澄みを捨てる

LB-Kanを20ml加える。　　　　　　　　　　　　

②③④に関して

②、③、④

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる。

LBを2ml加える。　　　　　　　　　　　　

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる。

LBを2ml加える。

↓冷却遠心(3700rom,3min)

上澄み捨てる。

LB-Ampを6ml加える。

48欠Deep Well

①:2ml	②:2ml,AHL	②:2ml	③:2ml	④2ml	-
-	-	-	-	-	-
①:1ml,②:1ml,IPTG:2μl	①:100μl,②:1ml,IPTG:1.1μl	①10μl,②1ml,IPTG:101μl	①:1μl,②1ml,IPTG:1.001μl	①:1ml,②:100μl,IPTG:1.1μl	①:1ml,②:10μl,IPTG:1.01μl
-	-	-	-	-	-
①:1ml,③:1ml,IPTG:2μl	①:100μl,③:1ml,IPTG:1.1μl	①:10μl,③:1ml,IPTG:1.01μl	①:1μl,③:1ml,IPTG	①:1ml,③:100μl,IPTG:1.1μl	①:1ml,③:10μl,IPTG:1.01μl
-	-	-	-	-	-
①:1ml,④:1ml,IPTG:2μl	①100μl,④:1ml,IPTG:1.1μl	①:10μl,④:1ml,IPTG:1.0μl	①:1μl,④:1ml,IPTG:1.001μl	①:1ml,④:100μl,IPTG:1.0μl	①:1ml,④:10μl,IPTG1.01μl
-	-	-	-	-	-

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 == 2008.9.1 ==
-・Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
+*Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
+*-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
+*-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
-<BR>結果→GFPが発現していた。
+*結果-->GFPが発現していた。-->-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
-<BR>→-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
+*ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-<BR>→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
+*-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
-<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
+混ぜ表
-<BR>混ぜ表
 <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 46: / Line 45: @@
 </table>
-<BR>UV照射テスト
-<BR>・-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
-<BR>・グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
-<BR>・37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
-<BR>・小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
-<BR>・乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
-<BR>・UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
-<BR>・10^4,10^5希釈し、20μlをプレートに撒いた。
-<BR>・37℃,12h後にコロニーを数える。
-<BR>コロニー数
+UV照射テスト
+*-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
+*グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
+*37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
+*小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
+*乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
+*UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
+*10<sup>4</sup>,10<sup>5</sup>希釈し、20μlをプレートに撒いた。
+*37℃,12h後にコロニーを数える。
+コロニー数
 <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
-<td>UV⊕・10^4</td><td>UV⊕・10^5</td><td>UV⊖・10^4</td><td>UV⊖・10^5</td>
+<td>UV+ 10<sup>4</sup></td><td>UV+ 10<sup>5</sup></td><td>UV-10<sup>4</sup></td><td>UV-10<sup>5</sup></td>
 <tr>
 <td>0min</td>
@@ Line 78: / Line 79: @@
 <tr>
 <td>2h</td>
-<td>5</td><td>1</td><td>-</td></td>-</td>
+<td>5</td><td>1</td><td>-</td><td>-</td>
 </tr>
 <tr>
@@ Line 91: / Line 92: @@
 <td>8h</td>
 <td>1</td><td>0</td><td>1155</td><td>106</td>
+</tr>
+</table>
+== 2008.9.2 ==
+UV照射実験
+*Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
+*37℃,12h後,ODを測定して10<sup>2</sup>~10<sup>3</sup>のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
+*新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
+*PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
+*UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
+*それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。
+*結果
+::PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。
+== 2008.9.12 ==
+*Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
+I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
+℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
+L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。
+混ぜ表
+<table width="100" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
+<td width="257"></td>
+<td>20%L-アラビノース</td><td>濃度</td>
+<tr>
+<td> ①</td>
+<td>0μl</td><td>0%(N.C)</td>
+</tr>
+<tr>
+<td> ②</td>
+<td>1.9μl</td><td>0.2%</td>
+</tr>
+<tr>
+<td> ③</td>
+<td>19μl</td><td>2%</td>
+</tr>
+<tr>
+<td> ④</td>
+<td>190μl</td><td>20%</td>
+</tr>
+<tr>
+<td> ⑤</td>
+<td>-</td><td>P.C</td>
+</tr>
+</table>
+L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。
+結果は以下のとおり。
+<table width="400" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
+<td width="257"></td>
+<td>①</td><td>②</td><td>③</td><td>④</td><td>⑤</td>
+<tr>
+<td>L-アラビノース入れて30分後</td>
+<td>8.890</td><td>9.752</td><td>10.10</td><td>9.413</td><td>9.701</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>L-アラビノース入れて1h後</td>
+<td>9.161</td><td>13.93</td><td>17.37</td><td>14.97</td><td>10.60</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>L-アラビノース入れて2h後</td>
+<td>9.417</td><td>27.96</td><td>40.25</td><td>29.87</td><td>10.72</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>L-アラビノース入れて6h後</td>
+<td>9.933</td><td>74.99</td><td>150.9</td><td>125.0</td><td>10.04</td>
+<tr>
+<td>L-アラビノース入れて12h後</td>
+<td>10.64</td><td>99.39</td><td>202.88</td><td>72.08</td><td>11.76</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>L-アラビノース入れて24h後</td>
+<td>14.66</td><td>105.6</td><td>447.3</td><td>33.31</td><td>17.11</td>
+</tr>
+</table>
+== 2008.9.13 ==
+Time Delay Test
+①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)
+②Plac-RhlI -Amp(BW)
+③Plac-LasI -Amp(BW)
+④Ptet-LuxI -Amp(BW)
+*プレ培
+①LB-Kan 2ml培養
+②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養
+④LB-Amp　2ml培養
+↓over night
+*本培
+ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。
+ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。
+ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。
+OD>2となったらWash
+*①に関して
+①
+↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+上澄みを捨てる
+LB-Kanを20ml加える。
+*②③④に関して
+②、③、④
+↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+上澄みを捨てる。
+LBを2ml加える。
+:::↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+上澄みを捨てる。
+LBを2ml加える。
+:::↓冷却遠心(3700rom,3min)
+上澄み捨てる。
+LB-Ampを6ml加える。
+欠Deep Well
+<table width="300" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
+<td width="257">①:2ml</td>
+<td>②:2ml,AHL</td><td>②:2ml</td><td>③:2ml</td><td>④2ml</td><td>-</td>
+<tr>
+<td>-</td>
+<td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>①:1ml,②:1ml,IPTG:2μl</td>
+<td>①:100μl,②:1ml,IPTG:1.1μl</td><td>①10μl,②1ml,IPTG:101μl</td><td>①:1μl,②1ml,IPTG:1.001μl</td><td>①:1ml,②:100μl,IPTG:1.1μl</td><td>①:1ml,②:10μl,IPTG:1.01μl</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>-</td>
+<td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>①:1ml,③:1ml,IPTG:2μl</td>
+<td>①:100μl,③:1ml,IPTG:1.1μl</td><td>①:10μl,③:1ml,IPTG:1.01μl</td><td>①:1μl,③:1ml,IPTG</td><td>①:1ml,③:100μl,IPTG:1.1μl</td><td>①:1ml,③:10μl,IPTG:1.01μl</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>-</td>
+<td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>①:1ml,④:1ml,IPTG:2μl</td>
+<td>①100μl,④:1ml,IPTG:1.1μl</td><td>①:10μl,④:1ml,IPTG:1.0μl</td><td>①:1μl,④:1ml,IPTG:1.001μl</td><td>①:1ml,④:100μl,IPTG:1.0μl</td><td>①:1ml,④:10μl,IPTG1.01μl</td>
+</tr>
+<tr>
+<td>-</td>
+<td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td>
 </tr>
 </table>

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