Team:Chiba/Demo experiments

From 2008.igem.org

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・receiver:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002] (BW)をLB-Amp 2mLで12hプレ培養し、colonyが1000位になるようにプレートに撒く。（プレート①）
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・Receiver(T9002)のプレ培養
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　　receiver:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002] (BW)をLB-Amp 2ml培養(37℃,12h)
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・Sender(S03623)のプレ培養
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　　sender:[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623] (BW)をLB-Amp 10ml培養(37℃,12h)
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・LBで12hプレ培養したsenderの菌液とLB-agar(50℃)を混ぜて(LB:LBagar=1:1)シャーレに流し込んで固まらせる。（プレート②）
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・プレート②ができる頃にプレート①のreceiverのcolonyがちょうど良い大きさ(プレートに撒いて12hくらい)になるようにする。
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・receiverのcolonyをニトロセルロースで写し取り、senderが入ったプレートの表面にはる。はったときからスタート。
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・37℃で培養。
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・決まった時間になったらUVを当ててGFPが見えるかチェックする。
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香取
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・Receiver(T9002)のプレ培養receiver:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002] (BW)をLB-Amp 2mLで12hプレ培養し、colonyが1000位になるようにプレートに撒く。（プレート①）
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・LBで12hプレ培養したsenderの菌液とLB-agar(50℃)を混ぜて(LB:LBagar=1:1)シャーレに流し込んで固まらせる。（プレート②）
・LBで12hプレ培養したsenderの菌液とLB-agar(50℃)を混ぜて(LB:LBagar=1:1)シャーレに流し込んで固まらせる。（プレート②）

Revision as of 14:14, 29 October 2008

Chiba-U.gif

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Contents

Demo Experiment ~Senders~

Method

  1. プレ培養
    1. 以下のグリストを各培養液2μL中にPick。
      1. LB-Amp, [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], (BW)
      2. LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0161 LuxI(no LVA)]), (XL10G)
      3. LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0178 LasI(no LVA)]), (XL10G)
    2. 37°Cでしんとう培養。12h
  2. 本培養
    1. プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
      1. LB-Amp, [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
      2. LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0161 LuxI(no LVA)]), [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0178 LasI(no LVA)])
    2. 37°Cでしんとう培養。4～5h。
  3. Wash
    1. 遠心管50μL中に10μLずつ培養液を移す。
    2. 20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
    3. 各遠心管にLB-Ampを加える。
      1. [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]が入った各遠心管に10μL
      2. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管に5μL
    4. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
    5. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管にLB-Ampを5μL添加
    6. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
    7. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管にLB-Ampを10μLずつ添加
  4. Mix
    1. Senderの[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]と[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]を、それぞれ1：1で[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]と混ぜる。
    2. 96穴シャロウプレートに100μLずつ入れていく。入れ方は図の通り。
      1. 緑の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]=1:1
      2. 赤の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]=1:1
      3. 無地の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]のみ
  5. 培養＆観察

Results

結果は以下の通り。

Team-Chiba-demo-mihon.gif *緑部分：LuxI　*赤部分：LasI

開始点

LuxIでGFP確認

LasIでもGFP確認

　


1枚目の写真は開始点。2枚目はLuxIの部分だけGFPを肉眼（蛍光灯光）で確認。３枚目はLuxIとLasI両方を確認したものです。

（それぞれ０時間、4時間、8時間後の映像。液量が100μLと少ないため、今までの実験（1000μL）での結果よりもGFP発現に時間がかかった。・・・コレ書かない方がいいのかなあ。）

--Yoshimi 13:41, 29 October 2008 (UTC)

Demo Experiment ~Receivers~

method


・Receiver(T9002)のプレ培養 　　receiver:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002] (BW)をLB-Amp 2ml培養(37℃,12h) ・Sender(S03623)のプレ培養 　　sender:[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623] (BW)をLB-Amp 10ml培養(37℃,12h) ・LBで12hプレ培養したsenderの菌液とLB-agar(50℃)を混ぜて(LB:LBagar=1:1)シャーレに流し込んで固まらせる。（プレート②）
・プレート②ができる頃にプレート①のreceiverのcolonyがちょうど良い大きさ(プレートに撒いて12hくらい)になるようにする。
・receiverのcolonyをニトロセルロースで写し取り、senderが入ったプレートの表面にはる。はったときからスタート。
・37℃で培養。
・決まった時間になったらUVを当ててGFPが見えるかチェックする。
香取



・Receiver(T9002)のプレ培養receiver:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002] (BW)をLB-Amp 2mLで12hプレ培養し、colonyが1000位になるようにプレートに撒く。（プレート①）
・LBで12hプレ培養したsenderの菌液とLB-agar(50℃)を混ぜて(LB:LBagar=1:1)シャーレに流し込んで固まらせる。（プレート②）
・プレート②ができる頃にプレート①のreceiverのcolonyがちょうど良い大きさ(プレートに撒いて12hくらい)になるようにする。
・receiverのcolonyをニトロセルロースで写し取り、senderが入ったプレートの表面にはる。はったときからスタート。
・37℃で培養。
・決まった時間になったらUVを当ててGFPが見えるかチェックする。
香取

result

菌数ふり実験

菌数比1:1 Team-Chiba-IMG 0322-1.JPG Team-Chiba-IMG 0331-1.JPG Team-Chiba-IMG 0340.JPG 

                   0h                      0.5h                         1.5h



菌数比1:100 Team-Chiba-IMG 0322-100.JPG Team-Chiba-IMG 0331.JPG Team-Chiba-IMG 0340-100.JPG Team-Chiba-IMG 0349-100.JPG 

                  0h                        0.5h                       1.5h                     2.0h


菌数比1:1000 Team-Chiba-IMG 0322-1000.JPG Team-Chiba-IMG 0331-1000.JPG Team-Chiba-IMG 0341-1000.JPG Team-Chiba-IMG 0352-1000.JPG Team-Chiba-IMG 0378-1000.JPG 

                0h                    0.5h              1.5h             2.0h                2.5h

いろんなレシーバー実験

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