Team:Chiba/Project/Experiments:Receiver Crosstalk

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AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。
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AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。
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蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。
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使った遺伝子回路は以下の通りある。
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:*RhlR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084004 (BBa_K084004)]
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:*LasR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084005 (BBa_K084005)]
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*'''Reporter'''
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:*Plux-GFP[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 (BBa_J37032)]
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===Method===

Revision as of 21:30, 29 October 2008

Chiba-U.gif

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Receiver Cross-talk

Design

Fig.　 Crosstalk
Table. LuxR family gene Data modified from M.RIVAS et.al. Biol Res 38: 283-297, (2005)
Fig. Comparison of the predicted Lux box. Data modified from A.Fekete et.al. Anal Bioanal Chem 387:455–467,(2007)

クオラムセンシングにおける、レシーバータンパクを変えてクロストークを起こさせる。
センダーを変えたときと同様に、他種生物由来のレシーバーでもAHLに応答することは知られている(1)(2)。
本来の組み合わせとは異なるAHLを受け取るレシーバーの応答時間は遅くなり、遺伝子発現が遅くなる。
異なる生物はそれぞれに異なるLuxRタイプのタンパク質を持ち、それぞれアシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLに応答する。生物種によって異なるAHLと、それに応答するLuxRタイプのタンパク質はTableに示すとおりである。 Pseudomonas aeruginosa由来のRhlR,LasRも3OC6HSLを受け取ることがわかっている。


また、LuxR protein familyはLux boxという特定の配列を持ったプロモーター下にある遺伝子の発現を活性化する。(Fig. ) Lux boxも生物種によって配列が異なるが、ほとんど変わらない配列を持っているために違った生物種のLuxR protein familyであっても、AHLが存在下で遺伝子発現を活性化すると考えられる。


Experiment

LuxR protein familyを変えてクロストークさせる実験を行った。

AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。

AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。

AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。

蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。

使った遺伝子回路は以下の通りある。

  • Sender
    • AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]


LuxI-sender Chiba.gif

  • Transcriptional regulator
  • LuxR

LuxR-p15A Chiba.gif

  • RhlR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084004 (BBa_K084004)]

RhlR-p15A Chiba.gif

  • LasR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084005 (BBa_K084005)]

LasR-p15A Chiba.gif

  • CinR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084006 (BBa_K084006)]

CinR-p15A Chiba.gif

  • Reporter
  • Plux-GFP[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 (BBa_J37032)]

Plux-GFP-pMB1 Chiba.gif


Method

more about Receiver phase crosstalk

Result & Discussion

Fig.Time Delay Test LuxI-LuxR
Fig.Time Delay Test LuxI-LasR
Fig.Time Delay Test LuxI-RhlR


more about experimental result



Demo ~Receivers~

English:
日本語:
固体培地中にセンダー[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623],(Ptet-LuxI) を混ぜ、固体培地表面にレシーバーのコロニーをN.Cフィルターで移す。 センダーの作るAHLは培地中を移動し、表面のレシーバーがAHLを一定濃度感知すればGFPを発現 する。一種のセンダーに対し、様々な種類のレシーバーを用いることで時間差が生じることを確認する。

用いるレシーバーは・・・


・シグナル自体を分解するAiia を利用する

・レシーバーの遺伝子回路を含むプラスミドのコピーナンバーの変化

・レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れる 　　　　　


・確認の仕方
N.Cフィルターをはった個体培地を37°Cで培養し、時間(30min?)ごとにUVをあててGFPが見えるかチェックする。
香取

Results

--->more about Demo experiments detail

--->more about Demo experiments detail


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