Team:Chiba/protocol/DNA Purification/sigma/j

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井山
井山
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コメント（冨永）
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*溶出操作で，50ulとするとDNAを一部損失します。高濃度のDNA溶液が必要な場合，培養液を5 mlくらい用意して，100 ulで溶出するといいと思います。

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Sigma Miniprep kit によるDNA精製プロトコル

  1. スピンダウンしたペレットに、Resuspension Solution（冷蔵庫に保管）を200μL入れてボルテックスで懸濁
  2. Lysis Bufferを200μL加え、４～６回チューブを転倒させる。この操作で菌の細胞膜を溶かしている。この時DNAが壊れてしまう可能性があるので優しく取り扱うこと。
  3. Neutralization Bufferを350μL加え、すぐにチューブを４～６回転倒させて完全に混ぜる。中和による沈殿が固まってしまうのを防ぐため、このBufferを加えたら溶液をすばやく優しくまぜる。
  4. 10分間、遠心機で13,000rpm設定で遠心。白い塊状のペレット（菌の死骸）が形成する。このとき同時にカラムの洗浄を行ってしまうのが良い。Colum Solution 500μLを蓋ナシのチューブに入れたカラムに加えて、1分間遠心（13,000rpm）。１分間とあるが、洗浄操作なので10分やっても大丈夫らしい。遠心を終えたカラムは水気を取っておくこと。
  5. 4の上澄み液を直接、またはピペッティングによりさきほど洗浄したカラムに入れる。
  6. 1分間遠心（13,000rpm）してカラムにDNAをつける。
  7. カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける。
  8. Optional Bufferを500μL入れて1分間遠心（13,000rpm）。シリカを洗う。またWash系のBufferは粘性が低くとびやすいので、ピペットマンの操作には十分気をつけること。
  9. カラムのチューブにたまった溶液を捨てて、チューブの水気を取ってからカラムをつける。
  10. Wash Bufferを500μL入れて1分間遠心（13,000rpm）。カラムをこの操作で洗浄する。
  11. 9～10の操作を繰り返す。
  12. 残っているWash Bufferを除去するためにさらに2～3分間空遠心（13,000rpm）。Buffer中のEtha-OHが残っていると後に続く酵素反応が阻害されてしまうため。
  13. カラムを新しい1.5μLのマイクロ遠心チューブにセットする。この時、Etha-OHをとばすために少しだけ時間をおくとよい。
  14. Elution Bufferを100μL（個人的に50μLがちょうどいいので50μLでの抽出を勧める。）を各カラムの中央に敵かし１分間静置。（もっと長時間でも良い）ここでカラムからDNAの溶出を行う。
  15. 1分間遠心（13,000rpm）し、溶液を新しいチューブに移し変えて蓋を閉めたらミニプレ完了！


井山

コメント（冨永）

  • 溶出操作で，50ulとするとDNAを一部損失します。高濃度のDNA溶液が必要な場合，培養液を5 mlくらい用意して，100 ulで溶出するといいと思います。
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