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2008.9.1

Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
結果-->GFPが発現していた。-->-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check

混ぜ表

	Double	Single
dH₂O	1	2
XbaI	1	1
SpeI	1	-
BSA(×10)	1	1
NEB(×10)	1	1
DNA	5	5
TOTAL	10	10

UV照射テスト

-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
10⁴,10⁵希釈し、20μlをプレートに撒いた。
37℃,12h後にコロニーを数える。

コロニー数

	UV+ 10⁴	UV+ 10⁵	UV-10⁴	UV-10⁵
0min	423	74	271	156
10min	301	51	-	-
30min	139	7	-	-
1h	89	5	1040	54
2h	5	1	-	-
4h	2	0	254	50
6h	0	0	-	-
8h	1	0	1155	106

2008.9.2

UV照射実験

Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
37℃,12h後,ODを測定して10²~10³のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。

結果

PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。

2008.9.12

Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト

I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養。

37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。

L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。

混ぜ表

	20%L-アラビノース	濃度
①	0μl	0%(N.C)
②	1.9μl	0.2%
③	19μl	2%
④	190μl	20%
⑤	-	P.C

L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。

結果は以下のとおり。

	①	②	③	④	⑤
L-アラビノース入れて30分後	8.890	9.752	10.10	9.413	9.701
L-アラビノース入れて1h後	9.161	13.93	17.37	14.97	10.60
L-アラビノース入れて2h後	9.417	27.96	40.25	29.87	10.72
L-アラビノース入れて6h後	9.933	74.99	150.9	125.0	10.04
L-アラビノース入れて12h後	10.64	99.39	202.88	72.08	11.76
L-アラビノース入れて24h後	14.66	105.6	447.3	33.31	17.11

2008.9.13

Time Delay Test ①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)

②Plac-RhlI -Amp(BW)

③Plac-LasI -Amp(BW)

④Ptet-LuxI -Amp(BW)

プレ培

①LB-Kan 2ml培養

②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養

④LB-Amp　2ml培養

↓over night

本培

50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。

50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。

50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。

OD>2となったらWash

①に関して

①

↓冷却遠心(3700rpm,3min)　　　　　　　　　　

上澄みを捨てる

LB-Kanを20ml加える。　　　　　　　　　　　　

②③④に関して

②、③、④

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる。

LBを2ml加える。　　　　　　　　　　　　

↓冷却遠心(3700rpm,3min)

上澄みを捨てる。

LBを2ml加える。

↓冷却遠心(3700rom,3min)

上澄み捨てる。

LB-Ampを6ml加える。

48欠Deep Well

①:2ml	②:2ml,AHL	②:2ml	③:2ml	④2ml	-
-	-	-	-	-	-
①:1ml,②:1ml,IPTG:2μl	①:100μl,②:1ml,IPTG:1.1μl	①10μl,②1ml,IPTG:101μl	①:1μl,②1ml,IPTG:1.001μl	①:1ml,②:100μl,IPTG:1.1μl	①:1ml,②:10μl,IPTG:1.01μl
-	-	-	-	-	-
①:1ml,③:1ml,IPTG:2μl	①:100μl,③:1ml,IPTG:1.1μl	①:10μl,③:1ml,IPTG:1.01μl	①:1μl,③:1ml,IPTG	①:1ml,③:100μl,IPTG:1.1μl	①:1ml,③:10μl,IPTG:1.01μl
-	-	-	-	-	-
①:1ml,④:1ml,IPTG:2μl	①100μl,④:1ml,IPTG:1.1μl	①:10μl,④:1ml,IPTG:1.0μl	①:1μl,④:1ml,IPTG:1.001μl	①:1ml,④:100μl,IPTG:1.0μl	①:1ml,④:10μl,IPTG1.01μl
-	-	-	-	-	-

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 == 2008.9.1 ==
-・Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
+*Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
+*-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
+*-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
-<BR>結果→GFPが発現していた。
+*結果-->GFPが発現していた。-->-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
-<BR>→-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
+*ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-<BR>→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
+*-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
-<BR>-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
-<BR>混ぜ表
+混ぜ表
 <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 45: / Line 45: @@
 </table>
-<BR>UV照射テスト
-<BR>・-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
-<BR>・グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
-<BR>・37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
-<BR>・小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
-<BR>・乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
-<BR>・UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
-<BR>・10^4,10^5希釈し、20μlをプレートに撒いた。
-<BR>・37℃,12h後にコロニーを数える。
-<BR>コロニー数
+UV照射テスト
+*-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
+*グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
+*37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
+*小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
+*乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
+*UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
+*10<sup>4</sup>,10<sup>5</sup>希釈し、20μlをプレートに撒いた。
+*37℃,12h後にコロニーを数える。
+コロニー数
 <table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 95: / Line 97: @@
 == 2008.9.2 ==
 UV照射実験
-<BR>・Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
+*Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
-<BR>・37℃,12h後,ODを測定して10<sup>2</sup>~10<sup>3</sup>のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
+*37℃,12h後,ODを測定して10<sup>2</sup>~10<sup>3</sup>のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
-<BR>・新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
+*新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
-<BR>・PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
+*PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
-<BR>・UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
+*UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
-<BR>・それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。
+*それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。
-<BR><BR>結果
-<BR>PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。
+*結果
+::PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。
 == 2008.9.12 ==
-Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
+*Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
-<BR>I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
-<BR>37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
+I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
-<BR>L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。
+℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
+L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。
-<BR>混ぜ表
+混ぜ表
 <table width="100" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 <td width="257"></td>
@@ Line 135: / Line 143: @@
 </tr>
 </table>
-<BR>L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。
-<BR>結果は以下のとおり。
+L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。
+結果は以下のとおり。
@@ Line 169: / Line 179: @@
 == 2008.9.13 ==
 Time Delay Test
-<BR>①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)
+①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)
-<BR>②Plac-RhlI -Amp(BW)
-<BR>③Plac-LasI -Amp(BW)
-<BR>④Ptet-LuxI -Amp(BW)
-<BR>プレ培
+②Plac-RhlI -Amp(BW)
-<BR>①LB-Kan 2ml培養
-<BR>②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養
+③Plac-LasI -Amp(BW)
-<BR>④LB-Amp　2ml培養
-<BR>↓over night
+④Ptet-LuxI -Amp(BW)
-<BR><本培>
-<BR>50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。
+*プレ培
-<BR>50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。
+①LB-Kan 2ml培養
-<BR>50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。
-<BR>OD>2となったらWash
+②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養
-<BR><BR>①に関して
-<BR>①
+④LB-Amp　2ml培養
-<BR>↓冷却遠心(3700rpm,3min)
-<BR>上澄みを捨てる
+↓over night
-<BR>LB-Kanを20ml加える。
-<BR><BR>②③④に関して
+*本培
-<BR> ②、③、④
-<BR> ↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。
-<BR>上澄みを捨てる。
-<BR>LBを2ml加える。
+ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。
-<BR>    ↓冷却遠心(3700rpm,3min)
-<BR>上澄みを捨てる。
+ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。
-<BR>LBを2ml加える。
-<BR>    ↓冷却遠心(3700rom,3min)
+OD>2となったらWash
-<BR>上澄み捨てる。
-<BR>LB-Ampを6ml加える。
+*①に関して
+①
+↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+上澄みを捨てる
+LB-Kanを20ml加える。
+*②③④に関して
+②、③、④
+↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+上澄みを捨てる。
+LBを2ml加える。
+:::↓冷却遠心(3700rpm,3min)
+上澄みを捨てる。
+LBを2ml加える。
+:::↓冷却遠心(3700rom,3min)
+上澄み捨てる。
+LB-Ampを6ml加える。
-</table>
 欠Deep Well
 <table width="300" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">

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