Team:Chiba/jk/α

From 2008.igem.org

(Difference between revisions)
(→2008.8.30)
(→2008.8.30)
Line 549: Line 549:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
→30μlゲル抽出
 
<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/gel extraction|Gel Extraction]]'''
<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/gel extraction|Gel Extraction]]'''
 +
<BR>混ぜ表
 +
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 +
<td width="57"></td>
 +
<td></td>
 +
<tr>
 +
<td>Digestion産物</td>
 +
<td>30</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Dye</td>
 +
<td>6</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>TOTAL</td>
 +
<td>36</td>
 +
</tr>
 +
</table>
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/zymo|Zymo]]'''
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/zymo|Zymo]]'''
-
<BR>5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
+
<BR>→NFW5μlで溶出
 +
<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gel check|Gel Check]]'''
 +
<BR>混ぜ表
 +
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 +
<td width="57"></td>
 +
<td></td>
 +
<tr>
 +
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
 +
<td>4</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>DNA</td>
 +
<td>1</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Dye</td>
 +
<td>1</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>TOTAL</td>
 +
<td>6</td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
→ゲルチェックOK
<BR>
<BR>
<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
Line 591: Line 630:
<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/gel extraction|Gel Extraction]]'''
<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/gel extraction|Gel Extraction]]'''
-
 
+
<BR>混ぜ表
-
 
+
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
-
 
+
<td width="57"></td>
 +
<td></td>
 +
<tr>
 +
<td>Digestion産物</td>
 +
<td>30</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Dye</td>
 +
<td>6</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>TOTAL</td>
 +
<td>36</td>
 +
</tr>
 +
</table>
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/zymo|Zymo]]'''
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/zymo|Zymo]]'''
 +
<BR>→NFW10μlで溶出
 +
<BR>→SAP:'''[[Team:Chiba/protocol/SAP|SAP]]'''
<BR>→SAP:'''[[Team:Chiba/protocol/SAP|SAP]]'''
<BR>混ぜ表
<BR>混ぜ表
Line 613: Line 668:
</tr>
</tr>
<tr>
<tr>
-
<td>SAP Buffer</td>
+
<td>SAP Buffer(×10)</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
</tr>
</tr>
Line 621: Line 676:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
<BR>5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
+
→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
 +
<BR>→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
 +
<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/zymo|Zymo]]'''
 +
→NFW5μlで抽出
 +
<BR>ゲルチェック:'''[[Team:Chiba/protocol/gel check|Gel Check]]'''
 +
<BR>混ぜ表
 +
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 +
<td width="57"></td>
 +
<td></td>
 +
<tr>
 +
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
 +
<td>4</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>DNA</td>
 +
<td>1</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Dye</td>
 +
<td>1</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>TOTAL</td>
 +
<td>6</td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
→ゲルチェックOK
<BR>Ligation:'''[[Team:Chiba/protocol/Ligation|Ligation]]'''
<BR>Ligation:'''[[Team:Chiba/protocol/Ligation|Ligation]]'''
Line 653: Line 734:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
 +
→25℃で2h放置
→Transformation(XL10G):'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
→Transformation(XL10G):'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
<BR>→CFU40(b.gは22)
<BR>→CFU40(b.gは22)
-
 
-
<BR>コロニーPCR(16コつつく):'''[[Team:Chiba/protocol/colonyPCR|ColonyPCR]]'''
 
-
<BR>混ぜ表
 
-
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 
-
<tr>
 
-
<td width="257">
 
-
</tr>
 
-
<tr>
 
-
<td>VF</td>
 
-
<td>2</td>
 
-
</tr>
 
-
<tr>
 
-
<td>VFR</td>
 
-
<td>2</td>
 
-
</tr>
 
-
<tr>
 
-
<td>dNTP</td>
 
-
<td>2</td>
 
-
</tr>
 
-
<tr>
 
-
<td>thermo pol buffer</td>
 
-
<td>2</td>
 
-
</tr>
 
-
<tr>
 
-
<td>Tag</td>
 
-
<td>0.3</td>
 
-
</tr>
 
-
<tr>
 
-
<td>dH2O</td>
 
-
<td>11.7</td>
 
-
</tr>
 
-
<tr>
 
-
<td>TOTAL</td>
 
-
<td>20</td>
 
-
</tr>
 
-
</table>
 
{| style="color:green;background-color:Maroon" cellpadding="3" cellspacing="3" border="1" bordercolor="white" width="100%" align="center"
{| style="color:green;background-color:Maroon" cellpadding="3" cellspacing="3" border="1" bordercolor="white" width="100%" align="center"

Revision as of 06:52, 20 September 2008

入力班のぺーじ。


Contents

2008.8.20

PCR:PCR
・BBa_J22136(2007)①
・BBa_J22136(2008)②
・BBa_J22141(2007)③
・BBa_J22141(2008)④
・BBa_E0612(2008)⑤

>
Sample No ①②③④⑤
DNA tamplate 11111
FW primer 55555
VR primer 55555
dNTPmix 1010101010
thermo pol buffer 1010101010
DNA pol(VENT) 11111
dH2O 6868686868
TOTAL 100100100100100


→gel check:Gel Check

>
Sample No ①②③④⑤
Sample DNA 11111
loading dye 11111
dH2O 44444
Total 66666

→どれもバンド出ず。




trnsformation:Transformation


・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)

→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(１個のみ)

2008.8.21

8.20にtransformationしたもの
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007) を２ml培養、12h。ただしコロニーが１個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 さらに1h培養した。

2008.8.22

mini prep:Mini Prep
2ml培養した
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
をミニプレした。


insert check:Digestion


BBa_J06650(2006)
BBa_J06650(2007)
BBa_J22136(2007)
BBa_J22141(2007)
BBa_R0051(2006)
BBa_R0051(2007)
BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。

混ぜ表

doublesimgle
dH2O 1425
10×BSA 710
10×NE 710
EcoRI 3.55
PstI 3.5-

2008.8.25

BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり

プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。


OD=0.495培養液 0.67μl
60%グリセロール 0.33μl
20%グリセロールストック(計) 1.00ml

2008.8.28

transformation:Transformation
BBa_I7106(2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してmini prep(60mlで溶出):mini Prep
→Digestion:Digestion
混ぜ表

double
dH2O 2
10×BSA 1
10×NE 1
EcoRI 0.5
PstI 0.5
DNA 5
TOTAL 10

Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl



PCR:PCR
RBS＋CI
混ぜ表

DNA 1
FW primer 2.5
VR primer 2.5
dNTPmix 5
thermo pol buffer 5
DNA pol(VENT) 1
dH2O 34
TOTAL 50


ゲルチェック:Gel Check


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

→濃度は33.6ng/μg


ベクターのPCR:PCR
BBa_I7106
混ぜ表

DNA 1
FW primer 5
VR primer 5
dNTPmix 10
thermo pol buffer 10
DNA pol(VENT) 1
dH2O 68
TOTAL 100


ゲルチェック:Gel Check


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

→バンド出ず。

2008.8.30


Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60

→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2μg)
TOTAL 60

→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
→SAP:SAP
混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer 10
TOTAL 30


5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用


Ligation:Ligation
混ぜ表

b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)


コロニーPCR(16コつつく):ColonyPCR
混ぜ表

VF 2
VFR 2
dNTP 2
thermo pol buffer 2
Tag 0.3
dH2O 11.7
TOTAL 20

→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
→mini prep:Mini Prep




Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60


ゲル抽出:Gel Extraction
混ぜ表

Digestion産物 30
Dye 6
TOTAL 36


→Zymo:Zymo
→NFW5μlで溶出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表

dH2O 4
DNA 1
Dye 1
TOTAL 6

→ゲルチェックOK

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2.25μg)
TOTAL 60


ゲル抽出:Gel Extraction
混ぜ表

Digestion産物 30
Dye 6
TOTAL 36


→Zymo:Zymo
→NFW10μlで溶出


→SAP:SAP
混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer(×10) 10
TOTAL 30

→37℃で1h、乾燥機(65℃)で15min,
→Binding Bufferを90μl加え、VORTEX
→Zymo:Zymo →NFW5μlで抽出
ゲルチェック:Gel Check
混ぜ表

dH2O 4
DNA 1
Dye 1
TOTAL 6

→ゲルチェックOK


Ligation:Ligation
混ぜ表

b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

→25℃で2h放置 →Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)

ホーム メンバー紹介 プロジェクト紹介 Parts Submitted to the Registry モデリング ノート
Retrieved from "http://2008.igem.org/Team:Chiba/jk/%CE%B1"