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Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j
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| - | **LB:>200 | + | **LB:>150,<200 |
**M9:?? | **M9:?? | ||
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Revision as of 03:58, 25 September 2008
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Contents |
Time-delay check
目的
T9002を導入した大腸菌は、AHL存在下でGFPを発現する。各種のAHL合成菌を添加し、添加後の蛍光強度の時間変化を調べる。
装置 & 試薬
- 装置
- しんとう培養器(37℃,30℃)
- 46 well plate(deep well)
- Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
- 試薬
- AHL(100uM,5uM,100nM)
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing T9002
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084007
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084008
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084009
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing S03623
あるいはXL10GOLD Cultere
プロトコル
プレ培（O/N,測定日の前日）
- グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2ml,37℃)。
翌日
T9002
- 培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
- Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。
- -->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
- 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
- 48 deep well plateに、1mlずつ分注。
others
- 培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
- Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
- -->新しいLB-Amp培地を3mlずつ加え、pipettingにより再懸濁。
-->この操作を二回繰り返す
- 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
- 48 deep well plateに、所定量分注。
測定
- 96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
- 37℃でしんとう培養
- 2h後、3h後…に、100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
- 測定条件
- 測定条件
- 測定前-->shake:On time = 1min,Off time = 10 sec,
- 測定-->integration time = 1000ms
- Beam width:Normal Beam
- Wavelength pair = 485nm(excitation) and 527nm(emission)
issues? discussion
蛍光強度がいくつ以上なら目視で確認できるのか-->閾値
- 液体培地
- LB:>150,<200
- M9:??
- PSB:??
