Team:Chiba/notebook/input/september

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2008.9.1

・Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
結果→GFPが発現していた。
→-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check

混ぜ表

	Double	Single
dH₂O	1	2
XbaI	1	1
SpeI	1	-
BSA(×10)	1	1
NEB(×10)	1	1
DNA	5	5
TOTAL	10	10

UV照射テスト
・-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
・グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
・37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
・小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
・乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
・UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
・10^4,10^5希釈し、20μlをプレートに撒いた。
・37℃,12h後にコロニーを数える。

コロニー数

	UV+ 10⁴	UV+ 10⁵	UV-10⁴	UV-10⁵
0min	423	74	271	156
10min	301	51	-	-
30min	139	7	-	-
1h	89	5	1040	54
2h	5	1	-	-
4h	2	0	254	50
6h	0	0	-	-
8h	1	0	1155	106

2008.9.2

UV照射実験
・Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
・37℃,12h後,ODを測定して10²~10³のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
・新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
・PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
・UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
・それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。

結果
PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。

2008.9.13

Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
L-アラビノースを

混ぜ表

	20%L-アラビノース	濃度
①	-	N.C
②	1.9μl	0.2%
③	19μl	2%
④	190μl	20%
⑤	-	P.C

ネガティブコントロールとして

	①	②	③	④	⑤
L-アラビノース入れて30分後	8.890	9.752	10.10	9.413	9.701
アラビノース入れて1h後	9.161	13.93	17.37	14.97	10.60
アラビノース入れて2h後	9.417	27.96	40.25	29.87	10.72
アラビノース入れて6h後	9.933	74.99	150.9	125.0	10.04
アラビノース入れて12h後	10.64	99.39	202.88	72.08	11.76>
アラビノース入れて24h後		14.66	105.6	447.3	33.31>	17.11

@@ Line 158: / Line 158: @@
 </tr>
 <tr>
-<td>6h</td>
+<td>アラビノース入れて6h後</td>
 <td>9.933</td><td>74.99</td><td>150.9</td><td>125.0</td><td>10.04</td>
 <tr>
-<td>12h</td>
+<td>アラビノース入れて12h後</td>
 <td>10.64</td><td>99.39</td><td>202.88</td><td>72.08</td><td>11.76></td>
 </tr>
 <tr>
-<td>24h</td>
+<td>アラビノース入れて24h後</td>
 <td></td><td>14.66</td><td>105.6</td><td>447.3</td><td>33.31></td><td>17.11</td>
 </tr>
 </table>