Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j

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Time-delay check

目的 Purpose

To Confirm that communication using non-endogenous molecules results in slower activation of receivers.

装置 and 試薬 Equipments　and Materials

装置 Equipment
- shaking incubator(37°C,30°C)
- 46-well plate(deep well)
- Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)

試薬 Materials
- AHL(100uM)
- E.coli Culture Containing T9002
- E.coli Culture Containing plasmids you will testing

プロトコル Protocol [1]

プレ培（O/N,測定日の前日）,Culturing overnight (before the testing day):

グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2mL,37°C )。

Inoculate all cultures you will testing from gloycerol stocks into 2mL of LB-ampicillin liquid medium.
Also inoculate a culture containing T9002 into 2mL of LB-ampicillin liquid medium.
Incubate all cultures with shaking at 37°C(O/N).

翌日,Following day

T9002

培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。

-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。

新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
48　deep well plateに、1mlずつ分注。

others

培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。

-->新しいLB-Amp培地を3mlずつ加え、pipettingにより再懸濁。

-->この操作を二回繰り返す

新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
48　deep well plateに、所定量分注。

測定

96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
37°Cでしんとう培養

2h後、3h後…に、100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。

測定条件

測定前-->shake:On time = 1min,Off time = 10 sec,

測定-->integration time = 1000ms

Beam width:Normal Beam

Wavelength pair = 485nm(excitation) and 527nm(emission)

issues? discussion

蛍光強度がいくつ以上なら目視で確認できるのか-->閾値

@@ Line 20: / Line 20: @@
 **E.coli Culture Containing plasmids you will testing
-=== プロトコル Protocol ===
+=== プロトコル Protocol [https://2008.igem.org/wiki/index.php?title=Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j&action=edit&section=4]===
-プレ培（O/N,測定日の前日）
-*グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2ml,37℃)。
-翌日<Br>
+====プレ培（O/N,測定日の前日）,Culturing overnight (before the testing day):====
-T9002
-*培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
+*グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2mL,37°C )。
-*Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。
+#Inoculate all cultures you will testing from gloycerol stocks into 2mL of LB-ampicillin liquid medium.
+#Also inoculate a culture containing T9002 into 2mL of LB-ampicillin liquid medium.
+#Incubate all cultures with shaking at 37°C(O/N).
+====翌日,Following day====
+*T9002
+#培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
+#Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。
 :-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
-*新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
+#新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
-*48　deep well plateに、1mlずつ分注。
+#48　deep well plateに、1mlずつ分注。
-others
-*培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
-*Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
+*others
+#培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
+#Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
 :-->新しいLB-Amp培地を3mlずつ加え、pipettingにより再懸濁。
 -->この操作を二回繰り返す
-*新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
+#新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
-*48　deep well plateに、所定量分注。
+#48　deep well plateに、所定量分注。
-測定
+*測定
-*96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
+#96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
-*37℃でしんとう培養
+#37°Cでしんとう培養
-*2h後、3h後…に、100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
+#2h後、3h後…に、100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
-**測定条件<Br>
+*測定条件<Br>
 ::測定前-->shake:On time = 1min,Off time = 10 sec,
 ::測定-->integration time = 1000ms