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Team:Chiba/Sender experiments
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| - | Senders( | + | Senders(JW1908),T9002(JW1908)@37°C |
菌数μL、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000 | 菌数μL、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000 | ||
*CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。 | *CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。 | ||
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*Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。 | *Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。 | ||
| - | Senders(BW),T9002(BW)@ | + | Senders(BW),T9002(BW)@30°C |
*特に37℃で行ったときと差はない | *特に37℃で行ったときと差はない | ||
*BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。 | *BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。 | ||
*次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。 | *次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。 | ||
| - | Senders(XL10G),T9002(BW)@ | + | Senders(XL10G),T9002(BW)@37°C |
*SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。 | *SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。 | ||
*この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。 | *この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。 | ||
:（８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325） | :（８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325） | ||
| - | Senders(XL10G),T9002(BW)@ | + | Senders(XL10G),T9002(BW)@30°C |
*37℃で行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245） | *37℃で行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245） | ||
*LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。 | *LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。 | ||
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:また、差が一番でたのが30℃で行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。 | :また、差が一番でたのが30℃で行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。 | ||
| - | Senders(XL10G),T9002(BW)@RT( | + | Senders(XL10G),T9002(BW)@RT(25°C) |
*どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。 | *どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。 | ||
（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う。） | （ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う。） | ||
Revision as of 07:19, 29 October 2008
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Signal molecule sender
Design
Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration(2).This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.
Experiment
To Confirm that communication using non-endogenous molecules results in slower activation of receivers.
冨永
Senders
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 plac+rbs+LasI]
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084008 plac+rbs+RhlI]
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 plac+rbs+LuxI]
Receiver
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)]
Method
1.Crosstalk test
To characterize quorum sensing crosstalk, constitutive AHL senders were mixed with constitutive receivers and measure fluorescence intensity.
- Transformed Senders into E.coli strains(XL10GOLD) and Receiver into E.coli strain(JW1908).
- Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h
- Mixed them.
- Incubated at 30°C.
- Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.
Result
Crosstalk test
目視実験
- 試験管内の培養液(2mL)が、緑色を呈しているときの蛍光強度：150～200。
--Masahiro 07:16, 29 October 2008 (UTC)
Senders(JW1908),T9002(JW1908)@37°C 菌数μL、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
- CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。
- RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
- Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。
Senders(BW),T9002(BW)@30°C
- 特に37℃で行ったときと差はない
- BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。
- 次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。
Senders(XL10G),T9002(BW)@37°C
- SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
- この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。
- （８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）
Senders(XL10G),T9002(BW)@30°C
- 37℃で行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245）
- LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。
- Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった。
- また、差が一番でたのが30℃で行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。
Senders(XL10G),T9002(BW)@RT(25°C)
- どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。
（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う。）
--Yoshimi 06:14, 29 October 2008 (UTC)
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