Team:Chiba/AHL Receiver Phase

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LuxR protein familyを変えてクロストークさせる実験を行った。
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AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。
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AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。
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AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。
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蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。
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使った遺伝子回路は以下の通りある。
*'''Sender'''
*'''Sender'''
**AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
**AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
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[[Image:R-family-crosstalk-test Chiba.gif|frame|right|Fig.R family crosstalk test]]

Revision as of 08:23, 29 October 2008

Chiba-U.gif

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Signal Molecule Receiver Phase

Quorum Sensing Crosstalk

Design

Table.1 LuxR family gene

異なる生物はそれぞれに異なるLuxRタイプのタンパク質を持ち、それぞれアシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLに応答する。生物種によって異なるAHLと、それに応答するLuxRタイプのタンパク質は以下の表のよう。 Pseudomonas aeruginosa由来のRhlR,LasRも3OC6HSLを受け取ることがわかっている。

また、LuxR protein familyはLux boxという特定の配列を持ったプロモーター下にある遺伝子の発現を活性化する。 Lux boxも生物種によって配列が異なるが、ほとんど変わらない配列を持っているために違った生物種のLuxR protein familyであっても、AHLが存在下で遺伝子発現を活性化すると考えられる。



Experiment

LuxR protein familyを変えてクロストークさせる実験を行った。

AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。

AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。

AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。

蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。

使った遺伝子回路は以下の通りある。

  • Sender
    • AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]


LuxI-sender Chiba.gif

Fig.R family crosstalk test
  • Receivers
    • LuxR

LuxR-p15A Chiba.gif

    • RhlR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084004 (BBa_K084004)]

RhlR-p15A Chiba.gif

    • LasR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084005 (BBa_K084005)]

LasR-p15A Chiba.gif

    • CinR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084006 (BBa_K084006)]

CinR-p15A Chiba.gif

  • Reporter
    • Plux-GFP[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 (BBa_J37032)]

Plux-GFP-pMB1 Chiba.gif



Result

Fig.　 Time Delay Test




Plasmid Copy number

Design

Experiment

Sender

  • AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
LuxI-sender Chiba.gif

Receiver

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)]

High-Copy-Receiver Chiba.gif

  • Low Copy Receiver

Low-Copy-Receiver Chiba.gif

Result

Fig.　 Time Delay Test


LuxR_mutant

Design

Fig.6 Location of the LuxR mutant in LuxR
Table.1 Seisitivity of LuxR mutants. Data modified from Collins et.al. Mol. Microbiol. 55, 712–723 (2005)


Collins et.al. described the hyper-sensitive variants of luxR to AHL.(Collins, C. H., Arnold, F. H. & Leadbetter, J. R. Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones. Mol. Microbiol. 55, 712–723 (2005))

私たちはmutated Receiverを用いることで、AHL感受性の違う２種類（WTと変異体）のレシーバーを用意し、delay-timeのバリエーションを増やした。 (小林)


Experiment

Result

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