Team:Chiba/Demo experiments

From 2008.igem.org

Revision as of 16:20, 29 October 2008

Demo Experiment ~Senders~

Method

1. プレ培養
   1. 以下のグリストを各培養液2mL中にPick。
      1. LB-Amp, [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], (BW)
      2. LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0161 LuxI(no LVA)]), (XL10G)
      3. LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0178 LasI(no LVA)]), (XL10G)
   2. 37°Cでしんとう培養。12h
2. 本培養
   1. プレ培養液を6.25%ずつ各培養液に添加する。
      1. LB-Amp, [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
      2. LB-Amp+0.2%Glu, [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0161 LuxI(no LVA)]), [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]([http://partsregistry.org/Part:BBa_J04500 plac+rbs]+[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0178 LasI(no LVA)])
   2. 37°Cでしんとう培養。4～5h。
3. Wash
   1. 遠心管50mL中に10mLずつ培養液を移す。
   2. 20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
   3. 各遠心管にLB-Ampを加える。
      1. [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]が入った各遠心管に10mL
      2. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管に5mL
   4. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
   5. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管にLB-Ampを5mL添加
   6. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った遠心管を20°C,3600rpmで6min遠心。上澄みを捨てる。
   7. [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]が入った各遠心管にLB-Ampを10mLずつ添加
4. Mix
   1. Senderの[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]と[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]を、それぞれ1：1で[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]と混ぜる。
   2. 96穴シャロウプレートに100μLずつ入れていく。入れ方は図の通り。
      1. 緑の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 BBa_K084012]:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]=1:1
      2. 赤の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 BBa_K084007]:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]=1:1
      3. 無地の部分に[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]のみ
5. 培養＆観察

Results

結果は以下の通り。

*緑部分：LuxI　*赤部分：LasI

0 h

4 h (Lux I GFP detected)

8 h (Lux I GFP and Las I GFP detected)

1枚目の写真は開始点。2枚目はLuxIの部分だけGFPを肉眼（蛍光灯光）で確認。３枚目はLuxIとLasI両方を確認したものです。

（それぞれ０時間、4時間、8時間後の映像。液量が100μLと少ないため、今までの実験（1000μL）での結果よりもGFP発現に時間がかかった。・・・コレ書かない方がいいのかなあ。）

--Yoshimi 13:41, 29 October 2008 (UTC)

Demo Experiment ~Receivers~

method-菌数ふり実験

1. Receiver(T9002)のプレ培養
   1. Receiver:[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW)をLB-Amp 2ml培養(37°C,12h)
   2. プレ培養したReceiver([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW))をコロニーが1000個くらいになるようにプレートにまく。
2. Sender(S03623)のプレ培養
   1. Sender:[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW)をLB-Amp 50ml遠心管で10ml培養(37°C,12h)(1,2の2本)
3. senderのWash
   1. 培養液([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW))が入った遠心管(2本)を20°C,3600rpmで6min遠心後、上澄みを捨てる。
   2. 各遠心管にLB-Amp10mlを加える。
   3. 同様の操作をあと2回行った。
4. 固体プレート作り
   1. LB-Ampで12hプレ培養したSender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))の培養液-1(10ml)とLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜてsender入りの固体培地-1を作る。
   2. LB-Ampで12hプレ培養したSender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))の培養液-2(100μl)をLB-Amp(9.9ml)に混ぜ、100倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))入りの固体培地-2を作る。
   3. LB-Ampで12hプレ培養したSenderの培養液-2(10μl)をLB-Amp(9.99ml)に混ぜ、1000倍希釈。この菌液10mlとLB-Amp-agar(50°C)(10ml)を混ぜて、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))入りの固体培地-3を作る。
   4. ネガティブコントロール用としてLB-Amp(10ml)と、LB-Amp-agar(10ml)を混ぜ、固体培地を作った。
5. ニトロセルロースでリフト
   1. Receiver([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002](BW))のcolonyをニトロセルロースフィルターに写し取り、Sender([http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623](BW))が入った固体培地(1~3)と、Senderなし(ネガティブコントロール用)の固体培地の上に置き(t=0)、菌の濃度(100倍,1000倍希釈)によってcolonyが光りだすまでの時間がどう変化するか調べた。
6. GFPの確認方法
   1. 37°Cで培養しているプレートを30分ごとにUV(312nm)を当てて、GFPが見えるか確認した。

香取

method

result-菌数ふり実験

希釈なし

                   0h                          0.5h                          1.5h

１００倍希釈

                  0h                          0.5h                         1.5h                         2.0h

１０００倍希釈

                0h                     0.5h                  1.5h                2.0h                2.5h

result-いろんなレシーバー実験

         0h                   0.5h                       1.0h                    1.5h

1=N.C

2=[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(high copy)

3=ptet-luxR-(low copy),[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 BBa_J37032]:plux-GFP(high copy)

4=[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]:ptet-luxR-plux-GFP(low copy)

5=ptet-mLuxR(too sensitive)-plux-GFP

6=N.C

7=ptet-luxR-plux-GFP-plac-aiiA

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