Team:Chiba/Reporter

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==Experiment==
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[[Image:Reporter method Chiba.jpg|rifht|thumb|'''Fig. '''レポーターのタイムレスポンスの実験方法]]
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大腸菌:XL10G
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Starain:XL10G Kan<sup>R</sup>
*蛍光たんぱく
*蛍光たんぱく

Revision as of 16:41, 29 October 2008

Chiba-U.gif

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Reporter

本プロジェクトではある一定時間がたった時に、遺伝子発現が起こるタイマーを作ることが目的

レシーバーの遺伝子発現から確認までのタイムラグができるだけ少ない出力が必要

そこで候補となったのは、以下の3種類

  • 蛍光たんぱく
  • 化学発光(luciferase)
  • 染色　(LacZ and X-gal assay)


蛍光たんぱくとβ-gal(lacZ)を実験で使用した。


蛍光たんぱくとしてGFP、maturationの早いVenus YFP[http://www.nature.com/nbt/journal/v20/n1/full/nbt0102-87.html|(1)],目視での確認が容易なmCherry[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15558047|(2)],を選んだ。

Luciferaseは化学発光であるために、発現の確認には暗所でなければならない。使用条件が限られてしまうため候補から外した

Experiment

Fig. レポーターのタイムレスポンスの実験方法

Starain:XL10G KanR

  • 蛍光たんぱく
  • GFP
  • pGFPuv
  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
Reporter 9002 chiba.gif
  • Venus YFP
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K084003 BBa_K084003]
K084003 chiba.gif
  • pLac-Venus YFP
PLac Venus Chiba.gif
  • mCherry
  • pLac-mCherry
PLac mChe Chiba.gif
  • β-gal (X-gal assay)
  • PUC19(plac-LacZ)
  • 装置 Equipment
shaking incubator
Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)
46-well plate(deep well)
96-well plate(deep well)
Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
Beckman Allegratm X-12R Centrifuga(Beckman Coulter)


  • 固体編

固体培地(pLac:0.2%グルコース入り)にまく
コロニーを新しい固体培地(pLac:IPTG, plux:AHL,　LacZ:IPTG&X-gal入り）にコロニーリフトする,計測開始
37°Cのしんとう培養器で培養
30分ごとに目視で確認できるか観察

  • 液体編

プレ培
コロニーを固体培地からピックし,LB培養液2ml（pLacであれば0.2%グルコース入り）で12時間培養(37°C)
本培
OD値を計測して、菌数を合わせるため培養液を1/200に希釈する。
OD=1.00くらいになるまで37°Cで培養
生理食塩水で洗浄(2.0min 8,000rpm)x2
46穴または96穴deep wellにM9(2ml)
IPTG(最終濃度0.1mM)またはAHL(最終濃度100nM)を加えて、計測開始
30分ごとに蛍光強度、OD値を計測、また目視で確認できるか観察

Result & discussion

  • LacZはX-galの濃度によって目視での確認時間が変わった
Table. X-gal濃度を変化させ、染色の様子を測定した結果
  • 液体、固体似たような結果になった（目視での確認時間）
Table. それぞれのレポーター遺伝子の評価をした結果


FigUVを当てた固体培地上のレポーター

このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である

  • X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間より遅い
  • X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる

以上の2つの理由から蛍光タンパク質が適している

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