Team:Chiba/Experiments:copy number

From 2008.igem.org

(Difference between revisions)
(→Method)
(→Design)
Line 16: Line 16:
===Design===
===Design===
[[Image:Receiver copy number chiba.jpg|left]]
[[Image:Receiver copy number chiba.jpg|left]]
 +
In this section, we intended to make an time-delay by differing the luxR protein's amount per cell.(*1) AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた。
 +
To do this, we used a different copy number plasmid of the Receivers. (*1)
 +
 +
レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える<br>
レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える<br>
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する<br>
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する<br>
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた<br>
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた<br>
<br clear=all>
<br clear=all>
 +
 +
 +
 +
<nowiki>*</nowiki>1：英語が壊滅的に変です。。
 +
===Experiment===
===Experiment===
oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。
oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。

Revision as of 22:04, 29 October 2008

Chiba-U.gif

Home The Team The Project Parts Submitted to the Registry Reference Notebook Acknowledgements


Copy number of Receiver Plasmid

Design

Receiver copy number chiba.jpg

In this section, we intended to make an time-delay by differing the luxR protein's amount per cell.(*1) AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた。 To do this, we used a different copy number plasmid of the Receivers. (*1)


レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた


*1：英語が壊滅的に変です。。

Experiment

oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

  • Sender
  • Receivers
**[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623 (AHL autoinucer)]

LuxI-sender Chiba.gif

    • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)] |

High-Copy-Receiver Chiba.gif

  • Low Copy Receiver

Low-Copy-Receiver Chiba.gif



これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。

Method

  1. Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-colE1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(JW1908).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
  3. Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
  4. Washed sender and receivers.
  5. Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
  6. Incubated at 30°C.
  7. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR　Thermo ELECTRON CORPORATION)

Result & Discussion

Fig.　 Time Delay Test


(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。

この理由は

  1. GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
  2. LuxRの合成量が少なすぎる。

が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-colE1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-colE1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Data is not shown) このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。 したがって理由1が有力である。




>Back to the project page

Home The Team The Project Parts Submitted to the Registry Notebook
Retrieved from "http://2008.igem.org/Team:Chiba/Experiments:copy_number"