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Team:Chiba/Experiments:copy number
From 2008.igem.org
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(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。 | (Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。 | ||
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Revision as of 01:44, 30 October 2008
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Copy number of Receiver Plasmid
Design
In this section, we intended to make an time-delay by differing the luxR protein's amount per cell.(*1) AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた。 To do this, we used a different copy number plasmid of the Receivers. (*1)
レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた
*1：英語が壊滅的に変です。。
Experiment
oriがpMB1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15AのローコピーベクターにのせかえたBBa_T9002を使用した。
これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。
以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。
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| **[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623 (AHL autoinucer)]
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これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。
Method
- Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-pMB1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(JW1908).
- Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
- Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
- Washed sender and receivers.
- Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
- Incubated at 30°C.
- Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR Thermo ELECTRON CORPORATION)
Result & Discussion
(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。
この理由は
- GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
- LuxRの合成量が少なすぎる。
が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-colE1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-colE1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Data is not shown) このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。 したがって理由1が有力である。
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