Team:Chiba/jk/γ/trs

From 2008.igem.org

(Difference between revisions)

Revision as of 02:01, 30 October 2008

Time Responce Liquid

Reporter

Fluorescent Protein

GFP

pGFPuv

BBa_T9002

Venus YFP

BBa_K084003

pLac-Venus YFP

mCherry

pLac-mCherry

β-gal (X-gal assay)

pUC19(plac-LacZα)

Equipment

shaking incubator

Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)

Method

Fig. レポーターのタイムレスポンスの実験方法

Strain:XL10G Kan^R

Agar plate experiment

Pre-culture
1. Picked and cultured the following plate stocks in 2mL of LB:
  1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
  2. LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
2. Cultured at 37°C for 12h.
Spread on plate
1. Spread on new plate
  1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
  2. LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
2. Cultured at 37°C for 12h.
Colony lift
1. Colony lift to inducible agar plate (containing IPTG or AHL)
  1. LB-Amp+0.2 mM IPTG agar plate, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
  2. LB-Amp+100 nM AHL agar plate, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
2. Incubate at 37 °C
Check expression every 30 min.

Result

Discussion

このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である

X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間より遅い
X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる

以上の2つの理由から蛍光タンパク質が適している

またGFP,YFPの発現時間までのタイムラグが一番少なかった

目視で確認した際、GFPのほうがYFPよりも目視で確認するのが容易であった

以上の理由から、出力はGFPとする。

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 ==Time Responce Liquid==
-'''装置&試薬'''
+===Reporter===
-*装置
+*Fluorescent Protein
-:*固体培地(0.2%glucouse,IPTG,AHL,X-gal)
+:*GFP
+::*pGFPuv
+::BBa_T9002
+:*Venus YFP
+::*BBa_K084003
+:::*pLac-Venus YFP
+:*mCherry
+pLac-mCherry
+*β-gal (X-gal assay)
+:*pUC19(plac-LacZα)
-*試薬
+===Equipment===
-:*IPTG(pLac)
+:shaking incubator
-:*AHL(pLux)
+::Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37&deg;C)
-:*X-gal(Lacz)
-:*ニトロセルロースフィルター
-'''プロトコル'''
-<br>0.2%glucouse入り培地に菌をまく(12時間)
-<br>固体培地(IPTG,AHL,X-gal)にニトロセルロースフィルターを使ってコロニーリフトする。
-<br>0min,30min,60min,90min,120min,150min,,,,,240minごとに変化があるか確認する。
-'''Result'''
+===Method===
+[[Image:Reporter method Chiba.jpg|rifht|thumb|'''Fig. '''レポーターのタイムレスポンスの実験方法]]
+Strain:XL10G Kan<sup>R</sup>
+*Agar plate experiment
+#Pre-culture
+##Picked and cultured the following plate stocks in 2mL of LB:
+###LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
+###LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
+##Cultured at 37°C for 12h.
+#Spread on plate
+##Spread on new plate
+###LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
+###LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
+##Cultured at 37°C for 12h.
+#Colony lift
+##Colony lift to inducible agar plate (containing IPTG or AHL)
+###LB-Amp+0.2 mM IPTG agar plate, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
+###LB-Amp+100 nM AHL agar plate, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
+##Incubate at 37 °C
+#Check expression every 30 min.
+===Result===
 *[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0829|29,August,2008]]
 *[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0902|2,September,2008]]
 *[[Team:Chiba/jk/γ/trs/0910|10,September,2008]]
+===Discussion===
+このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である
+*X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間より遅い
+*X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる
+以上の2つの理由から蛍光タンパク質が適している
+またGFP,YFPの発現時間までのタイムラグが一番少なかった
+*目視で確認した際、GFPのほうがYFPよりも目視で確認するのが容易であった
+以上の理由から、出力はGFPとする。