Team:Chiba/jk/α

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<BR>混ぜ表
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<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
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<td width="257"></td>
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<td>double</td>
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<td>dH<sub>2</sub>O</td>
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<td>6</td>
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</tr>
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<tr>
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<td>10×BSA</td>
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<td>10</td>
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</tr>
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<tr>
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<td>10×NE</td>
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<td>10</td>
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<td>PstI</td>
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<td>2</td>
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<tr>
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<td>XbaI</td>
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<td>2</td>
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<tr>
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<td>DNA</td>
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<td>33.6ng/μl×30μl(1μg)</td>
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<tr>
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<td>TOTAL</td>
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<td>60</td>
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</table>
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→30μlゲル抽出
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<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/gel extraction|Gel Extraction]]'''
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<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/zymo|Zymo]]'''
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<BR>5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
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<BR>Digestion:'''[[Team:Chiba/protocol/digestion|Digestion]]'''
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<BR>-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
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<BR>混ぜ表
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<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
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<td width="257"></td>
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<td>double</td>
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<tr>
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<td>dH<sub>2</sub>O</td>
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<td>4</td>
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</tr>
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<tr>
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<td>10×BSA</td>
 +
<td>10</td>
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</tr>
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<tr>
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<td>10×NE</td>
 +
<td>10</td>
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</tr>
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<tr>
 +
<td>PstI</td>
 +
<td>2</td>
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</tr>
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<tr>
 +
<td>SpeI</td>
 +
<td>4</td>
 +
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<tr>
 +
<td>DNA</td>
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<td>75ng/μl×30μl(2.25μg)</td>
 +
</tr>
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 +
<td>TOTAL</td>
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<td>60</td>
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<BR>ゲル抽出:'''[[Team:Chiba/protocol/gel extraction|Gel Extraction]]'''
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<BR>→Zymo:'''[[Team:Chiba/protocol/zymo|Zymo]]'''
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<BR>→SAP:'''[[Team:Chiba/protocol/SAP|SAP]]'''
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<BR>混ぜ表
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<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
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<td width="57"></td>
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<td></td>
 +
<tr>
 +
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
 +
<td>9</td>
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</tr>
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<tr>
 +
<td>DNA</td>
 +
<td>10</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>SAP</td>
 +
<td>1</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>SAP Buffer</td>
 +
<td>10</td>
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</tr>
 +
<tr>
 +
<td>TOTAL</td>
 +
<td>30</td>
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</tr>
 +
</table>
 +
<BR>5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用
 +
 +
<BR>Ligation:'''[[Team:Chiba/protocol/Ligation|Ligation]]'''
 +
<BR>混ぜ表
 +
<table width="200" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 +
<td width="257"></td>
 +
<td></td><td>b.g</td>
 +
<tr>
 +
<td>dH<sub>2</sub>O</td>
 +
<td>1.4</td><td>8</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Ligase</td>
 +
<td>1</td><td>1</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Ligase Buffer</td>
 +
<td>2</td><td>2</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Vector</td>
 +
<td>1.8</td><td>1</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Insert</td>
 +
<td>3</td><td>-</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>TOTAL</td>
 +
<td>10</td><td>10</td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
→Transformation(XL10G):'''[[Team:Chiba/protocol/transformation|Transformation]]'''
 +
<BR>→CFU40(b.gは22)
 +
 +
<BR>コロニーPCR(16コつつく):'''[[Team:Chiba/protocol/colonyPCR|ColonyPCR]]'''
 +
<BR>混ぜ表
 +
<table width="150" border="4" cellpadding="0" cellspacing="0" bordercolor="#000000">
 +
<tr>
 +
<td width="257">
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>VF</td>
 +
<td>2</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>VFR</td>
 +
<td>2</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>dNTP</td>
 +
<td>2</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>thermo pol buffer</td>
 +
<td>2</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>Tag</td>
 +
<td>0.3</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>dH2O</td>
 +
<td>11.7</td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td>TOTAL</td>
 +
<td>20</td>
 +
</tr>
 +
</table>
{| style="color:green;background-color:Maroon" cellpadding="3" cellspacing="3" border="1" bordercolor="white" width="100%" align="center"
{| style="color:green;background-color:Maroon" cellpadding="3" cellspacing="3" border="1" bordercolor="white" width="100%" align="center"

Revision as of 06:17, 20 September 2008

入力班のぺーじ。


Contents

2008.8.20

PCR:PCR
・BBa_J22136(2007)①
・BBa_J22136(2008)②
・BBa_J22141(2007)③
・BBa_J22141(2008)④
・BBa_E0612(2008)⑤

>
Sample No ①②③④⑤
DNA tamplate 11111
FW primer 55555
VR primer 55555
dNTPmix 1010101010
thermo pol buffer 1010101010
DNA pol(VENT) 11111
dH2O 6868686868
TOTAL 100100100100100


→gel check:Gel Check

>
Sample No ①②③④⑤
Sample DNA 11111
loading dye 11111
dH2O 44444
Total 66666

→どれもバンド出ず。




trnsformation:Transformation


・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)

→BBa_J22141のみコロニーがほとんど生えていなかった。(１個のみ)

2008.8.21

8.20にtransformationしたもの
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007) を２ml培養、12h。ただしコロニーが１個だけだったBBa_J22141は2ml培養の11h後にIPTGを20μl加え、 さらに1h培養した。

2008.8.22

mini prep:Mini Prep
2ml培養した
・BBa_R0051(2007)
・BBa_R0051(2006)
・BBa_J06650(2007)
・BBa_J06650(2006)
・BBa_J22136(2007)
・BBa_J22141(2007)
をミニプレした。


insert check:Digestion


BBa_J06650(2006)
BBa_J06650(2007)
BBa_J22136(2007)
BBa_J22141(2007)
BBa_R0051(2006)
BBa_R0051(2007)
BBa_R0051(2007)とBBa_R0051(2006)はsingleのみ、ほかはsingleとdoubleの両方。

混ぜ表

doublesimgle
dH2O 1425
10×BSA 710
10×NE 710
EcoRI 3.55
PstI 3.5-

2008.8.25

BBa_J22136(insert check済み)のグリセロールストックづくり

プレートに生えたコロニーをpickして、試験管で2ml培養(LB-Amp,37℃,12h)
培養した試験管から180μl,LB-Ampを880μlとって、OD=0.495にした。


OD=0.495培養液 0.67μl
60%グリセロール 0.33μl
20%グリセロールストック(計) 1.00ml

2008.8.28

transformation:Transformation
BBa_I7106(2007) 生えてきたコロニーを10ml培養してmini prep(60mlで溶出):mini Prep
→Digestion:Digestion
混ぜ表

double
dH2O 2
10×BSA 1
10×NE 1
EcoRI 0.5
PstI 0.5
DNA 5
TOTAL 10

Digestion 37℃、30分
プラスミドの濃度は33.6ng/μl



PCR:PCR
RBS＋CI
混ぜ表

DNA 1
FW primer 2.5
VR primer 2.5
dNTPmix 5
thermo pol buffer 5
DNA pol(VENT) 1
dH2O 34
TOTAL 50


ゲルチェック:Gel Check


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

→濃度は33.6ng/μg


ベクターのPCR:PCR
BBa_I7106
混ぜ表

DNA 1
FW primer 5
VR primer 5
dNTPmix 10
thermo pol buffer 10
DNA pol(VENT) 1
dH2O 68
TOTAL 100


ゲルチェック:Gel Check


PCR産物 1
Dye 1
dH2O 4
TOTAL 6

→バンド出ず。

2008.8.30


Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60

→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2μg)
TOTAL 60

→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
→SAP:SAP
混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer 10
TOTAL 30


5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用


Ligation:Ligation
混ぜ表

b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)


コロニーPCR(16コつつく):ColonyPCR
混ぜ表

VF 2
VFR 2
dNTP 2
thermo pol buffer 2
Tag 0.3
dH2O 11.7
TOTAL 20

→Insertチェックしたら1つだけ正しい位置にバンドが出現。そのコロニーを2ml培養し、mini prepした。
→mini prep:Mini Prep




Digestion:Digestion
x-RBS-cI-s-p(780bp)
混ぜ表

double
dH2O 6
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
XbaI 2
DNA 33.6ng/μl×30μl(1μg)
TOTAL 60

→30μlゲル抽出
ゲル抽出:Gel Extraction
→Zymo:Zymo
5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用

Digestion:Digestion
-e-x-Ptet-s-p-(PMB1,Amp)(Insert:54bp,Vector:2079bp)
混ぜ表

double
dH2O 4
10×BSA 10
10×NE 10
PstI 2
SpeI 4
DNA 75ng/μl×30μl(2.25μg)
TOTAL 60


ゲル抽出:Gel Extraction



→Zymo:Zymo
→SAP:SAP
混ぜ表

dH2O 9
DNA 10
SAP 1
SAP Buffer 10
TOTAL 30


5μ抽出,うち1μlをゲルチェック→OK,4μlはLigation用


Ligation:Ligation
混ぜ表

b.g
dH2O 1.48
Ligase 11
Ligase Buffer 22
Vector 1.81
Insert 3-
TOTAL 1010

→Transformation(XL10G):Transformation
→CFU40(b.gは22)


コロニーPCR(16コつつく):ColonyPCR
混ぜ表

VF 2
VFR 2
dNTP 2
thermo pol buffer 2
Tag 0.3
dH2O 11.7
TOTAL 20
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