"
Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j
From 2008.igem.org
(Difference between revisions)
(New page: == Part BBa_T9002:== === 目的 === T9002を導入した大腸菌は、AHL存在下でGFPを発現する。各種のAHL合成菌を添加し、添加後の蛍光強度の時間変化を...) |
(→プロトコル) |
||
| Line 20: | Line 20: | ||
=== プロトコル === | === プロトコル === | ||
プレ培（O/N,測定日の前日） | プレ培（O/N,測定日の前日） | ||
| - | * | + | *グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2ml,37℃)。 |
| - | + | ||
| - | 翌日 | + | 翌日<Br> |
| + | T9002 | ||
*培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。 | *培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。 | ||
| - | *Wash-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。 | + | *Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。 |
:-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。 | :-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。 | ||
| - | + | *新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。 | |
*48 deep well plateに、1mlずつ分注。 | *48 deep well plateに、1mlずつ分注。 | ||
| - | * | + | others |
| + | *培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。 | ||
| + | *Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。 | ||
| + | :-->新しいLB-Amp培地を3mlずつ加え、pipettingにより再懸濁。 | ||
| + | -->この操作を二回繰り返す | ||
| + | *新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。 | ||
| + | *48 deep well plateに、所定量分注。 | ||
| + | |||
| + | 測定 | ||
*96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。 | *96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。 | ||
*37℃でしんとう培養 | *37℃でしんとう培養 | ||
| Line 38: | Line 46: | ||
::測定-->integration time = 1000ms | ::測定-->integration time = 1000ms | ||
::Beam width:Normal Beam | ::Beam width:Normal Beam | ||
| - | ::Wavelength pair = 485nm(excitation) and 527nm(emission) | + | ::Wavelength pair = 485nm(excitation) and 527nm(emission) |
=== issues? discussion === | === issues? discussion === | ||
*蛍光強度がいくつ以上なら目視で確認できるのか | *蛍光強度がいくつ以上なら目視で確認できるのか | ||
Revision as of 05:16, 22 September 2008
Contents |
Part BBa_T9002:
目的
T9002を導入した大腸菌は、AHL存在下でGFPを発現する。各種のAHL合成菌を添加し、添加後の蛍光強度の時間変化を調べる。
装置 & 試薬
- 装置
- しんとう培養器(37℃,30℃)
- 46 well plate(deep well)
- Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
- 試薬
- AHL(100uM,5uM,100nM)
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing T9002
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084007
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084008
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084009
- E.coli BW⊿FliC Culture Containing S03623
プロトコル
プレ培（O/N,測定日の前日）
- グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2ml,37℃)。
翌日
T9002
- 培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
- Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。
- -->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
- 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
- 48 deep well plateに、1mlずつ分注。
others
- 培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
- Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
- -->新しいLB-Amp培地を3mlずつ加え、pipettingにより再懸濁。
-->この操作を二回繰り返す
- 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
- 48 deep well plateに、所定量分注。
測定
- 96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
- 37℃でしんとう培養
- 2h後、3h後…に、100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
- 測定条件
- 測定条件
- 測定前-->shake:On time = 1min,Off time = 10 sec,
- 測定-->integration time = 1000ms
- Beam width:Normal Beam
- Wavelength pair = 485nm(excitation) and 527nm(emission)
issues? discussion
- 蛍光強度がいくつ以上なら目視で確認できるのか
