Team:Chiba/Sender experiments

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'''Fig.''' senders crosstalk test.senders strain XL10Gold,Receiver strain JW1908.Reaction temparature was 30°C.All measurements are averages from three replicate cultures with error bars representing standard deviations.Labeling:LuxI,RhlI,LasI means fluorescence induced by AHLs synthesized by LuxI,RhlI,LasI respectively.]]<br clear="all">
'''Fig.''' senders crosstalk test.senders strain XL10Gold,Receiver strain JW1908.Reaction temparature was 30°C.All measurements are averages from three replicate cultures with error bars representing standard deviations.Labeling:LuxI,RhlI,LasI means fluorescence induced by AHLs synthesized by LuxI,RhlI,LasI respectively.]]<br clear="all">
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目視実験
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*蛍光強度150～200で、肉眼でGFPを確認することができる。
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*軸ラベル、直します。
 
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*RhlIとLuxIでは、GFP inductionにかかる時間はほとんど同じであった.
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Senders(BW),T9002(BW)@37
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菌数μL、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000
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*CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。
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*RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
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*Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。
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*LasIは、GFP inductionが他より約2時間遅れた.
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Senders(BW),T9002(BW)@30
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*特に37℃で行ったときと差はない
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*BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。
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*次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。
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Senders(XL10G),T9002(BW)@37
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*SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
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*この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。
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:（８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）
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（冨永）
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Senders(XL10G),T9002(BW)@30
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*37℃で行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245）
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*LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。
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*Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった。
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:また、差が一番でたのが30℃で行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。
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Senders(XL10G),T9002(BW)@RT(25℃)
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*どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。
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（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う。）
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--[[User:Yoshimi|Yoshimi]] 06:14, 29 October 2008 (UTC)

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Chiba-U.gif

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Signal molecule sender

Design

Sender switch Chiba.jpg

Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration(2).This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.


Fig.4 AHL varieties


Experiment

To Confirm that communication using non-endogenous molecules results in slower activation of receivers.

冨永

Fig.5 Senders crosstalk

Senders

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084007 plac+rbs+LasI]

Tet-lasi chiba.gif

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084008 plac+rbs+RhlI]

Tet-rhli chiba.gif

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 plac+rbs+LuxI]

Tet-luxi chiba.gif

Receiver

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)]

Reporter 9002 chiba.gif

Method

1.Crosstalk test

To characterize quorum sensing crosstalk, constitutive AHL senders were mixed with constitutive receivers and measure fluorescence intensity.

  1. Transformed Senders into E.coli strains(XL10GOLD) and Receiver into E.coli strain(JW1908).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h
  3. Mixed them.
  4. Incubated at 30°C.
  5. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.

more details...

Result

Crosstalk test

Fig. senders crosstalk test.senders strain XL10Gold,Receiver strain JW1908.Reaction temparature was 30°C.All measurements are averages from three replicate cultures with error bars representing standard deviations.Labeling:LuxI,RhlI,LasI means fluorescence induced by AHLs synthesized by LuxI,RhlI,LasI respectively.

目視実験

  • 蛍光強度150～200で、肉眼でGFPを確認することができる。


Senders(BW),T9002(BW)@37 菌数μL、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

  • CinI+LVAとLuxRのクロストークはどの菌数比でもおこらない。
  • RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
  • Sender同士のクロストークの時差（蛍光強度200に達するまでの時間）は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。

Senders(BW),T9002(BW)@30

  • 特に37℃で行ったときと差はない
  • BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。
  • 次回からはSender側の株をXL10Gに代えて実験を行う。

Senders(XL10G),T9002(BW)@37

  • SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
  • この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。
（８ｈ後の最終蛍光強度（菌比１：１）、LasI：LuxI(Ptet)：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）

Senders(XL10G),T9002(BW)@30

  • 37℃で行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245）
  • LasとLux(Plac)１：１で蛍光強度200に達するまでの時間に2．5時間の時差がみられた。
  • Rhlのタグなしとタグ付きの差は、８ｈ後の最終強度にしか現れなかった。
また、差が一番でたのが30℃で行ったこの実験で、タグなし：タグつき＝507：456。

Senders(XL10G),T9002(BW)@RT(25℃)

  • どのSenderもGFP強度20～50の範囲。ネガコン（T9002のみ）の値、40前後と変わらず。

（ただし、静置培養のため、しんとう培養した30℃や37℃とは条件が違う。）

--Yoshimi 06:14, 29 October 2008 (UTC)


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