Team:Chiba/Reporter

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Revision as of 13:41, 29 October 2008

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レスポンスの早いレポーターを選ぶことが目的

Fig. レポーターのタイムレスポンスの実験方法

大腸菌:XL10G

shaking incubator(37°C,30°C)

Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)

46-well plate(deep well)

96-well plate(deep well)

Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)

Beckman Allegratm X-12R Centrifuga(Beckman Coulter)

固体培地(pLacであれば0.2%グルコース入り)にまく
コロニーを新しい固体培地(pLacであればIPTG, ptetであればAHL,　LacZならばIPTGとX-gal）にコロニーリフトする＝スタート
37°Cのしんとう培養器で培養
30分ごとに目視で確認できるか観察

プレ培
コロニーを固体培地からピックし、LB培養液2ml（pLacであれば0.2%グルコース入り）で12時間培養(37°C)
本培
OD値を計測して、菌数を合わせるため培養液を1/200に希釈する。
OD=1.00くらいになるまで37°Cで培養

このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である

分解されやすいLuciferineやX-galを基質とするLuciferaseやβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまう

そのため、基質のいらない蛍光タンパク質が適している。

基質も合成するLuxCDABEを発現させると、レスポンスが早くなる可能性がある。

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 [[Image:Reporter method Chiba.jpg|rifht|thumb|'''Fig. '''レポーターのタイムレスポンスの実験方法]]
 大腸菌:XL10G
-*Luciferase
-:*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J52008 BBa_J52008]+[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620 BBa_F2620]
-:*[http://partsregistry.org/Part:BBa_J32007 BBa_J32007]
 *蛍光たんぱく
 :*GFP
 ::*pGFPuv
-:*YFP
+::*[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
+:*Venus YFP
+[[Image:K084003 chiba.gif]]
 ::*[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K084003 BBa_K084003]
 :*mCherry
-::*ptet-mCherry
+::*pLac-mCherry
 *β-gal (X-gal assay)
 :*PUC19(plac-LacZ)