Team:Chiba/Project

From 2008.igem.org

Abstract

Fig.1 Project desgin

"Team : Chiba - E.coli time manager"

　　We control the timing of gene expression by using multiple signaling devices.To this end,we utilize molecules associated with Quorum sensing, a phenomenon that allows bacteria to communicate with each other.Our project uses two classes of bacteria: senders and receivers. Senders produce signaling molecules, and Receivers are activated only after a particular concentration of this molecule is reached.Although different quorum sensing species have slightly different signaling molecules, these molecules are not completely specific to their hosts and cross-species reactivity is observed [http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract (1)],[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity (2)]. Communication using non-endogenous molecules is less sensitive, and requires a higher signal concentration to take effect.This results in slower activation of receivers.

Introduction

Fig.2 Team logo

「タイマー」は私たちの生活を便利にする非常に優れた装置であり、様々な場所で利用されている。 例えば、キッチンタイマーや電子レンジなどにもタイマーが使われている。キッチンタイマーは、設定された時間が経つと音を鳴らして私たちに知らせるという機能を持つ。電子レンジは温めるという行為と平行して時間の測定を行い、一定時間が経つとその行為を終了させるという機能を持つ。

このタイマーという便利な機能を生物にも導入できないだろうか。タイマーを生物システムに組み込めば、生体機能を時間的に制御することができると私たちは考えた。Chibaの"E.coli Time Manager"は、蓄積を利用したタイマーシステムだ。詳しくはプロジェクトデザインで説明する。私たちはこの"E.coli Time Managar"を使うことで以下のようなシステム作成が可能になると考えている。

１つめはセキュリティーシステムだ。

測定時間の違う複数のタイマーを同時に起動させれば、決まった順序で自動的に遺伝子発現をおこすことができる。これによって順々に文字を浮き上がらせたり、消し去ったりすることで情報漏洩を防ぐことができる。

２つめは賞味期限装置。

今までの賞味期限は規定された保存状態でどれだけの時間、食品の安全が保証されるのかというものだった。食品がある一定温度にどれだけ放置されたかを計ることで、それに対する菌の活性の経緯知ることが出来る。これが出来ればより本質に近い賞味期限を提示することができるだろう。

３つめは積分装置。

例えばUVを入力としたとする。UVは揮発的な入力であるが、私たちのシステムはその入力を蓄積によって記憶する。これによって被爆計や、揮発性汚染の警告装置を作ることが出来るだろう。

Our project

Fig. Our system

従来:消えていく物質の存在時間によって時間調節する。Missouri Miners 2007 "A biological timer"

千葉:常に物質が一定の割合で蓄積されるとき、ある閾値超えるまでの時間調節する。

調節する方法には、二つが挙げられる。

• 蓄積するときの割合を変える。

• 閾値自体を変える。

• 右の絵は一定の割合で水がある容器の中にたまっていく様子を示している。
• ここでは、容器に水がたまることった時が閾値を超えた時とする
• 一番上は蓄積するスピードが速く、容器が小さいのでたまる時間は短い
• 真ん中は蓄積する容器は小さいが、蓄積するスピードが遅いためにたまる時間は遅くなる
• 一番下は蓄積するスピードが遅く、容器が大きいためにたまる時間がより遅くなる

System design

Fig. System design

１、全体の説明

蓄積したシグナル分子によって遺伝子発現が起こる細胞間コミュニケーションであるクオラムセンシングを利用する。

クオラムセンシングではLuxI protein familyがシグナル分子であるAHLを合成する。

LuxR protein familyはAHLに応答し、Lux promoter下の遺伝子を発現する。

LuxI protein familyによって合成されたAHLを蓄積していく->ある点(応答閾値)まで蓄積すると、遺伝子発現が起こる

合成されたAHLが応答閾値に達するまでの時間を変えることで、遺伝子発現までの時間を調整することができる。

応答閾値までAHLが蓄積すると、GFPを発現する

その蛍光強度によって遺伝子発現を調べる

２、How to control the timing of gene expression

Quorum Sensing Cross-talk

クオラムセンシングにおける送受信装置は由来する生物ごとに特有のセットをなしているが、異種の送受信装置同士もCross-talkすることが分かっている。 Cross-talkによるコミュニケーションは感度が鈍いため、Receiverの活性化が遅くなる。

more about Quorum Sensing Cross-talk

Experiments and Result

Signal Molecule Sender Phase

Design

Utilize Quorum Sensing Cross-talk　

English:Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity ⁽²⁾].This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.日本語:異なる生物はそれぞれに異なるLuxIタイプのタンパク質を持ち、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。それぞれの生物種のLuxIタイプのタンパク質、それが合成する分子名は以下の表のようである。 (Fig.4).AHLを受け取り応答するLuxRタンパク質はVibrio fischeri由来であり、3OC6HSLに応答する。しかし、他種生物由来のAHLにも応答することが知られており、このとき、より高い濃度のAHLが必要となる[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity ⁽²⁾].AHLがゆっくり溜まっていく時、LuxRは3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。 (冨永)

more about AHL sender phase design

Result

Crosstalk test

Fig. senders crosstalk test.senders strain XL10Gold,Receiver strain JW1908.Reaction temparature was 30°C.All measurements are averages from three replicate cultures with error bars representing standard deviations.Labeling:LuxI,RhlI,LasI means fluorescence induced by AHLs synthesized by LuxI,RhlI,LasI respectively.

• RhlIとLuxIでは、GFP inductionにかかる時間はほとんど同じであった.

• LasIは、GFP inductionが他より約2時間遅れた.

（冨永）

more about Sender experiment and result

Signal Molecule Receiver Phase

English:

日本語:AHLを合成するSenderだけではなく、AHLを受け取る側のReceiverを変えれば、その応答時間を変えることができる。そこで私たちは、以下のいくつかの方法を考えた。

1. 一種類のSender（AHL<--LuxI）に対して、由来生物の異なるレシーバタンパク質でそれを受信する.
2. レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れることで、AHLに対する応答感度を上下させること.
3. レシーバーのコピーナンバーを変える.

Quorum-Sensing Crosstalk Fig.　 Crosstalk クオラムセンシングにおける、レシーバータンパクを変えてクロストークを起こさせる。 センダーを変えたときと同様に、他種生物由来のレシーバーでもAHLに応答することは知られている。 本来の組み合わせとは異なるAHLを受け取るレシーバーの応答時間は遅くなり、遺伝子発現が遅くなる。 more about Receiver phase crosstalk Fig.　 Time Delay Test more about experimental result

Plasmid Copynumber Fig. copynumber 遺伝子回路を含むプラスミドをもったレシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わるのだ more about Plasmid Copy number Fig. Time Delay Test クオラムセンシングに関わる遺伝子のベクタープラスミドのコピーナンバーを少なくすることで、遺伝子発現が遅くなる それと同時に、遺伝子発現の最大値自体も少なくなってしまう more about experimental result

LuxR mutant (Under construction)

レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れることで応答感度を上下させる

Fig. LuxR mutant

Signal Molecule Quencher

Design

AHL reporter with aiiA Express LuxR and aiiA constantly. AiiA degrades AHL as signaling molecule. Express GFP when the AHL concentration exceed the capacity of aiiA. This enables the delay of the activation time of receiver. more about AiiA Receiver Phase

Fig.　 Time Delay Test more about AiiA Receiver Experiment

Demo Experiments

実験内容とdataかるく

Demo experiments detail

English:
日本語:
固体培地中にセンダー（LuxI）を混ぜ、固体培地表面にレシーバーのコロニーをN.Cフィルターで移す。 センダーの作るAHLは培地中を移動し、表面のレシーバーがAHLを一定濃度感知すればGFPを発現 する。一種のセンダーに対し、様々なレシーバーを用いることで時間差が生じることを確認する。

用いるレシーバーは具体的に・・・

・シグナルを受け取るレシーバーを変える(クロストークの利用)

・シグナル自体を分解するAiia を利用する

・レシーバーの遺伝子回路を含むプラスミドのコピーナンバーの変化

・そしてレシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れる 　　　　　

・確認の仕方
37℃で培養しているreceiverに時間(30min?)ごとにUVをあててGFPが見えるかチェックする。
香取

Conclusion

Signal Molecule Sender phase

目視実験

• 蛍光強度150～200以上で、肉眼でGFPを確認することができる。

Senders(BW),T9002(BW)@37 菌数μL、Sender:Receiver＝500：500,100:1000,10:1000

• CinI+LVAとLuxRのクロストークはおこらない。
• RhlIが（RhlI+LVA、LasI、CinI+LVAの中で）一番クロストークする。
• Sender同士のクロストークの時差は、1時間以下の範囲でしか発生しなかった。

Senders(BW),T9002(BW)@30

• 特に37℃で行ったときと差はない
• BWはクオラムセンシングをしやすい株なので、Senderを変えてもたいした時差が見られなかった。

Senders(XL10G),T9002(BW)@37

• SenderをBW株にして行った実験よりも、8時間後の蛍光強度が平均で200くらい落ちた。
• この条件ではLasIのクロストークは起こりにくい。

（８ｈ後の最終蛍光強度、LasI：LuxI：RhlI：RhlI+LVA＝163：267：394：325）

Senders(XL10G),T9002(BW)@30

• 37℃で行った実験と比べ、LasIが活性。（８ｈ後の蛍光強度、37℃：30℃＝163：245）

とりあえずここまで。

--Yoshimi 03:57, 29 October 2008 (UTC)

Signal Molecule Receiver phase

Cross talk

クロストークさせると、発現量が大きく減少してしまうのでタイムラグを確認できるほど遺伝子が発現がGFPでは確認できなかった

LuxR以外のR protein familyには分解タグである,LVA tagがついていたので、もともと発現しにくいもの[http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract (1)]が、さらに発現が見えにくくなったと考えられる

Copy Number

コピーナンバーを変えても、発現量が大きく減少してしまう。

最終的な発現量が同じで、応答閾値の濃度が低くなるような変異LuxRを発現させることがレシーバーを変えてtime delayを起こすことに一番適している(?)

Signal Molecule Quencher phase

Future Work

references

1. [http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract M.K Winson et al.:Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors　for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing.FEMS Microbiology Letters 163 (1998) 185-192]
2. [http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity BBa_F2620:Specificity]
3. [http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.et al.:Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones.Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723]
4. [http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/151/11/3589 B. Koch. et al.:The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and inhibitors.Microbiology 151 (2005),3589-3602]

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