Team:Chiba/AHL Receiver Phase

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Chiba-U.gif

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Signal Molecule Receiver Phase

Quorum Sensing Crosstalk

Design

Table.1 LuxR family gene

異なる生物はそれぞれに異なるLuxRタイプのタンパク質を持ち、それぞれアシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLに応答する。生物種によって異なるAHLと、それに応答するLuxRタイプのタンパク質は以下の表のよう。 Pseudomonas aeruginosa由来のRhlR,LasRも3OC6HSLを受け取ることがわかっている。

Fig. Comparison of the predicted Lux box. Data modified from M.RIVAS et.al. Biol Res 38: 283-297, (2005)

また、LuxR protein familyはLux boxという特定の配列を持ったプロモーター下にある遺伝子の発現を活性化する。 Lux boxも生物種によって配列が異なるが、ほとんど変わらない配列を持っているために違った生物種のLuxR protein familyであっても、AHLが存在下で遺伝子発現を活性化すると考えられる。


Experiment

LuxR protein familyを変えてクロストークさせる実験を行った。

AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。

AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。

AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。

蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。

使った遺伝子回路は以下の通りある。

  • Sender
    • AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]


LuxI-sender Chiba.gif

Fig.R family crosstalk test
  • Receivers
    • LuxR

LuxR-p15A Chiba.gif

    • RhlR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084004 (BBa_K084004)]

RhlR-p15A Chiba.gif

    • LasR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084005 (BBa_K084005)]

LasR-p15A Chiba.gif

    • CinR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084006 (BBa_K084006)]

CinR-p15A Chiba.gif

  • Reporter
    • Plux-GFP[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 (BBa_J37032)]

Plux-GFP-pMB1 Chiba.gif



Result

Fig.Time Delay Test LuxI-LuxR
Fig.Time Delay Test LuxI-LasR
Fig.Time Delay Test LuxI-RhlR


さまざまなLux protein familyを発現させ、GFPの蛍光強度を測定した結果が左のグラフ

LuxRを発現させたとき、GFPは多く発現していることが分かるが、そのほかのRhlR,LasR,CinRを発現させた場合、ほとんど蛍光強度が上昇していない。 つまり、遺伝子発現が活性化されていることが確認できなかった。



Conclusion

クロストークさせると、発現量が大きく減少してしまうのでタイムラグを確認できるほど遺伝子が発現がGFPでは確認できなかった

LuxR以外のR protein familyには分解タグである,LVA tagがついていたので、もともと発現しにくいもの[http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract (1)]が、さらに発現が見えにくくなったと考えられる



Plasmid Copy number

Design

レシーバーとなるLuxR protein familyと、レポーターとなるGFPを含んだプラスミドのコピーナンバーを変えることで、遺伝子発現に時間差をつけることができると予想した。

Experiment

oriがpMB1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002にものと、T9002のoriがP15Aのローコピーベクターに乗ったバリエーションを作成した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

Sender

  • AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
LuxI-sender Chiba.gif

Receiver

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)]

High-Copy-Receiver Chiba.gif

  • Low Copy Receiver

Low-Copy-Receiver Chiba.gif

Result

Fig.　 Time Delay Test


Conclusion

コピーナンバーを変えても、発現量が大きく減少してしまう。

最終的な発現量が同じで、応答閾値の濃度が低くなるような変異LuxRを発現させることがレシーバーを変えてtime delayを起こすことに一番適している(?)

LuxR_mutant (Under Plannning)

Design

Fig.6 Location of the LuxR mutant in LuxR
Table.1 Seisitivity of LuxR mutants. Data modified from Collins et.al. Mol. Microbiol. 55, 712–723 (2005)


Collins et.al. described the hyper-sensitive variants of luxR to AHL.(Collins, C. H., Arnold, F. H. & Leadbetter, J. R. Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones. Mol. Microbiol. 55, 712–723 (2005))

私たちはmutated Receiverを用いることで、AHL感受性の違う２種類（WTと変異体）のレシーバーを用意し、delay-timeのバリエーションを増やした。 (小林)





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