Team:Chiba/Project

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Chiba-U.gif

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Abstract

E.coli time manager

We are constructing delay switches to control/preset the timing of target gene expression. Our project uses two classes of bacteria: senders and receivers. Senders produce signaling molecules, and receivers are activated only after a particular concentration of this molecule is reached. The combinatorial use of senders/receivers allows us to make a‘switching consortium’which activates different genes at the preset times.

As signaling molecules, we utilize molecules associated with Quorum sensing, a phenomenon that allows bacteria to communicate with each other. Although different quorum sensing species have slightly different signaling molecules, these molecules are not completely specific to their hosts and cross-species reactivity is observed (1),(2). Communication using non-endogenous molecules is less sensitive than the original, and requires a higher signal concentration to take effect. This reduced sensitivity results in the slower activation of receivers, thus creating a system in which different senders are activated after different amounts of time following signaling molecule release.

Introduction

Fig.1 Project design

VCR systems possess the time-recording function. Microwaves automatically stop heating when the right time comes. Using their presetting functions, we became free either from staying up late watching European succor game, and from worrying about our popcorn burned black while we are yelling to the game videotaped. This way, the timer functions have revolutionized our lifestyle.

We thought the same applies to the biotechnology; we would like to freely implement the 'timer switches” to various biological functions, hopefully independently and in parallel format. These “functions” include sensors, synthesizers, or degraders of bioactive compounds/ materials, transportation and secretion machineries, communications, getting/ sticking together, proliferation and cell death. If successful, we can program much more complex behaviors in cellular systems.

As one of the thousands of possible applications, we are trying to construct temporal imaging system using E. coli 'ink's that differ not in color but the 'timing' of coloration (fig). Over time, parts of images (or characters) are getting visible one by one, making animated message/ picture. In the end, the last ink get colorized, covering the entire image. Such system should be useful as a sort of secured communication board: we can convey our message to those who know the exact moment they should take a look. After a while, all the massage is gone.

Project Details

Fig. System design

私たちは，２種類のbacteriaからなる Switching consortium によって，水時計型のtime delay装置をつくる(more about [http://en.wikipedia.org/wiki/Water_clock Water clock-wikipedia.en]) 。 まず，Sender細胞が，ゆっくりとシグナルを合成する。それは次第に系に蓄積する。Receiverの応答感度に達した時，Receiverは遺伝子機能を起動するわけである（図説）。合成されたAHLが応答閾値に達するまでの時間を変えることで、遺伝子発現時間を調整することができる。そしてそのtime delay（preset time）は，sender側のmessage蓄積速度と，receiverの応答感度を調節すれば，任意に設定できる。

Signaling System

細胞間コミュニケーションであるクオラムセンシングを利用する。そもそもクオラムセンシングは，自分たちの密度がある閾値が一定値を超えたときに起動するものである（→もっと詳しく）。 Sender：LuxI protein familyがシグナル分子であるAHLを合成する。この分子は細胞膜を自由に通過し，Neighbering cellsにも感知される。 Receiver：常時LuxR proteinを発現し，AHLを監視している。AHL濃度がある値を超えると結合し，Lux promoter下の遺伝子発現をONにする。その応答閾値はLuxRとAHLとの親和性に依存している（文献）。


System Design

プランA: Cross-talk

プランB: Tuning

  • luxI合成量
  • luxR感受性
  • AHL分解


Chiba project design Sender.jpg

Signal Molecule Sender Phase

Chiba project design Receiver.jpg

Signal Molecule Receiver Phase

Chiba project design.jpg

Signal Molecule Quencher


Experiments and Result

Sender Crosstalk


Signal Molecule Receiver Phase

Chiba project design Receiver.jpg

English:

日本語:AHLを合成するSenderだけではなく、AHLを受け取る側のReceiverを変えれば、その応答時間を変えることができる。そこで私たちは、以下のいくつかの方法を考えた。

  1. 一種類のSender（AHL<--LuxI）に対して、由来生物の異なるレシーバタンパク質でそれを受信する.
  2. レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れることで、AHLに対する応答感度を上下させること.
  3. レシーバーのコピーナンバーを変える.



Quorum-Sensing Crosstalk

Fig.　 Crosstalk

クオラムセンシングにおける、レシーバータンパクを変えてクロストークを起こさせる。
センダーを変えたときと同様に、他種生物由来のレシーバーでもAHLに応答することは知られている(1)(2)。
本来の組み合わせとは異なるAHLを受け取るレシーバーの応答時間は遅くなり、遺伝子発現が遅くなる。
more about Receiver phase crosstalk

Fig.Time Delay Test LuxI-LuxR
Fig.Time Delay Test LuxI-LasR
Fig.Time Delay Test LuxI-RhlR


more about experimental result

Plasmid Copynumber

Fig. copynumber

遺伝子回路を含むプラスミドをもったレシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わるのだ
more about Plasmid Copy number

Fig. Time Delay Test

  • クオラムセンシングに関わる遺伝子のベクタープラスミドのコピーナンバーを少なくすることで、遺伝子発現が遅くなる
  • それと同時に、遺伝子発現の最大値自体も少なくなってしまう

more about experimental result




LuxR mutant (Under construction)

レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れることで応答感度を上下させる(3),(4)

Fig. LuxR mutant


Signal Molecule Quencher

Design

Chiba project design.jpg


  • AHL reporter with aiiA
Express LuxR and aiiA constantly. AiiA degrades
AHL as signaling molecule. Express GFP when
the AHL concentration exceed the capacity of aiiA.
This enables the delay of the activation time of receiver.

more about AiiA Receiver Phase
Fig.　 Time Delay Test


more about AiiA Receiver Experiment

Demo Experiments

Demo ~Senders~

一番時差が見られたSender遺伝子のLuxIとLasIをつかってデモ実験を行った。

LuxIおよびLasIの遺伝子がそれぞれ組み込まれた大腸菌（XL10G）と、

LuxRの遺伝子が組み込まれた大腸菌（BW）を液体培養したものを 液量１：１で混ぜて、それらのGFPが発現するのを目視で観測した。


Results

結果は以下の通り。

Team-Chiba-demo-mihon.gif *緑部分：LuxI　*赤部分：LasI

Team-Chiba-demo-1.JPG　Team-Chiba-demo-2.JPG　Team-Chiba-demo-3.JPG　


1枚目の写真は開始点。2枚目はLuxIの部分だけGFPを肉眼（蛍光灯光）で確認。３枚目はLuxIとLasI両方を確認したものです。

（それぞれ０時間、4時間、8時間後の映像。液量が100μLと少ないため、今までの実験（1000μL）での結果よりもGFP発現に時間がかかった。・・・コレ書かない方がいいのかなあ。） --Yoshimi 11:04, 29 October 2008 (UTC)

-->more about Demo experiments detail

Demo ~Receivers~

English:
日本語:
固体培地中にセンダー[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623],(Ptet-LuxI) を混ぜ、固体培地表面にレシーバーのコロニーをN.Cフィルターで移す。 センダーの作るAHLは培地中を移動し、表面のレシーバーがAHLを一定濃度感知すればGFPを発現 する。一種のセンダーに対し、様々な種類のレシーバーを用いることで時間差が生じることを確認する。

用いるレシーバーは・・・

・シグナルを受け取るレシーバーを変える(クロストークの利用)：LuxR,LasR,RhlR

・シグナル自体を分解するAiia を利用する

・レシーバーの遺伝子回路を含むプラスミドのコピーナンバーの変化

・レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れる 　　　　　


・確認の仕方
N.Cフィルターをはった個体培地を37°Cで培養し、時間(30min?)ごとにUVをあててGFPが見えるかチェックする。
香取

Results

--->more Demo experiments detail

Conclusion

シグナル分子を3OC6HSLから3OC12HSLに変更することで、LuxRの応答時間を二時間遅らせることができた.

これらのSender実験とReceiver実験で時間差を作り出すことが出来たものを融合すれば、2時間以上の時間差の効果を期待することが出来る。


--Yoshimi 11:09, 29 October 2008 (UTC)

Future Work

さらにミューテーションやポジティブフィードバックループを利用することで、この時差を更に広げることが出来るだろう。

Applications

時間の蓄積（クロストーク）を使うと…

セキュリティーシステム GFPなどの目で確認できる文字（情報）を浮き上がらせてから、時間をおいて周りの菌にGFPを発現させる。
そうすとことによって、最初の文字（情報）を塗りつぶす。
もともと存在していた情報を消すことができる。

賞味期限装置 食品が傷む原因は細菌の活動が影響している。細菌の活動は温度に依存するので、温度変化を入力とする。
食品が傷む前にGFPを発現して私たちに知らせてくれる。
どれだけ時間変化が長くとも、短くとも私たちに知らせてくれる。

積分装置 消えてしまう入力（たとえばUV被ばく、汚染物質）をセンダーがAHLを出すことによって入力を記憶しておく。
AHLがたまり、危険量に達したことを知らせてくれる。
（杉山）

references

  1. [http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract M.K Winson et al.:Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors　for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing.FEMS Microbiology Letters 163 (1998) 185-192]
  2. [http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity BBa_F2620:Specificity]
  3. [http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.et al.:Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones.Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723]
  4. [http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/151/11/3589 B. Koch. et al.:The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and inhibitors.Microbiology 151 (2005),3589-3602]
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