Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j

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Contents

Time-delay check

目的

T9002を導入した大腸菌は、AHL存在下でGFPを発現する。各種のAHL合成菌を添加し、添加後の蛍光強度の時間変化を調べる。

装置 & 試薬

  • 装置
    • しんとう培養器(37℃,30℃)
    • 46 well plate(deep well)
    • Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
  • 試薬
    • AHL(100uM,5uM,100nM)
    • E.coli BW⊿FliC Culture Containing T9002
    • E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084007
    • E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084008
    • E.coli BW⊿FliC Culture Containing K084009
    • E.coli BW⊿FliC Culture Containing S03623

プロトコル

プレ培（O/N,測定日の前日）

  • グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2ml,37℃)。

翌日
T9002

  • 培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
  • Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。
-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
  • 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
  • 48　deep well plateに、1mlずつ分注。

others

  • 培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
  • Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
-->新しいLB-Amp培地を3mlずつ加え、pipettingにより再懸濁。

-->この操作を二回繰り返す

  • 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
  • 48　deep well plateに、所定量分注。

測定

  • 96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
  • 37℃でしんとう培養
  • 2h後、3h後…に、100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
    • 測定条件
測定前-->shake:On time = 1min,Off time = 10 sec,
測定-->integration time = 1000ms
Beam width:Normal Beam
Wavelength pair = 485nm(excitation) and 527nm(emission)

issues? discussion

  • 蛍光強度がいくつ以上なら目視で確認できるのか
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