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Team:Chiba/notebook/input/september
From 2008.igem.org
Contents |
2008.9.1
・Ptet＋RBS＋cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
結果→GFPが発現していた。
→-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは？
→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check
混ぜ表
| Double | Single | |
| dH2O | 1 | 2 |
| XbaI | 1 | 1 |
| SpeI | 1 | - |
| BSA(×10) | 1 | 1 |
| NEB(×10) | 1 | 1 |
| DNA | 5 | 5 |
| TOTAL | 10 | 10 |
UV照射テスト
・-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
・グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
・37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
・小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
・乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
・UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
・10^4,10^5希釈し、20μlをプレートに撒いた。
・37℃,12h後にコロニーを数える。
コロニー数
| UV+ 104 | UV+ 105 | UV-104 | UV-105 | |
| 0min | 423 | 74 | 271 | 156 |
| 10min | 301 | 51 | - | - |
| 30min | 139 | 7 | - | - |
| 1h | 89 | 5 | 1040 | 54 |
| 2h | 5 | 1 | - | - |
| 4h | 2 | 0 | 254 | 50 |
| 6h | 0 | 0 | - | - |
| 8h | 1 | 0 | 1155 | 106 |
2008.9.2
UV照射実験
・Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
・37℃,12h後,ODを測定して102~103のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
・新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
・PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
・UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ（2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用）のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
・それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。
結果
PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。
2008.9.12
Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②～⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①～⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。
混ぜ表
| 20%L-アラビノース | 濃度 | |
| ① | 0μl | 0%(N.C) |
| ② | 1.9μl | 0.2% |
| ③ | 19μl | 2% |
| ④ | 190μl | 20% |
| ⑤ | - | P.C |
L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。
結果は以下のとおり。
| ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | |
| L-アラビノース入れて30分後 | 8.890 | 9.752 | 10.10 | 9.413 | 9.701 |
| L-アラビノース入れて1h後 | 9.161 | 13.93 | 17.37 | 14.97 | 10.60 |
| L-アラビノース入れて2h後 | 9.417 | 27.96 | 40.25 | 29.87 | 10.72 |
| L-アラビノース入れて6h後 | 9.933 | 74.99 | 150.9 | 125.0 | 10.04 |
| L-アラビノース入れて12h後 | 10.64 | 99.39 | 202.88 | 72.08 | 11.76 |
| L-アラビノース入れて24h後 | 14.66 | 105.6 | 447.3 | 33.31 | 17.11 |
2008.9.13
Time Delay Test
①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)
②Plac-RhlI -Amp(BW)
③Plac-LasI -Amp(BW)
④Ptet-LuxI -Amp(BW)
プレ培
①LB-Kan 2ml培養
②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養
④LB-Amp 2ml培養
↓over night
<本培>
50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。
50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。
50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。
OD>2となったらWash
①に関して
①
↓冷却遠心(3700rpm,3min)
上澄みを捨てる
LB-Kanを20ml加える。
②③④に関して
②、③、④
↓冷却遠心(3700rpm,3min)
上澄みを捨てる。
LBを2ml加える。
↓冷却遠心(3700rpm,3min)
上澄みを捨てる。
LBを2ml加える。
↓冷却遠心(3700rom,3min)
上澄み捨てる。
LB-Ampを6ml加える。
48欠Deep Well
| ①:2ml | ②:2ml,AHL | ②:2ml | ③:2ml | ④2ml | |
| ①:1ml,②:1ml,IPTG:2μl | ①:100μl,②:1ml,IPTG:1.1μl | ①10μl,②1ml,IPTG:101μl | ①:1μl,②1ml,IPTG:1.001μl | ①:1ml,②:100μl,IPTG:1.1μl | ①:1ml,②:10μl,IPTG:1.01μl |
| ①:1ml,③:1ml,IPTG:2μl | ①:100μl,③:1ml,IPTG:1.1μl | ①:10μl,③:1ml,IPTG:1.01μl | ①:1μl,③:1ml,IPTG | ①:1ml,③:100μl,IPTG:1.1μl | ①:1ml,③:10μl,IPTG:1.01μl |
| ①:1ml,④:1ml,IPTG:2μl | ①100μl,④:1ml,IPTG:1.1μl | ①:10μl,④:1ml,IPTG:1.0μl | ①:1μl,④:1ml,IPTG:1.001μl | ①:1ml,④:100μl,IPTG:1.0μl | ①:1ml,④:10μl,IPTG1.01μl |
