Team:Chiba/Project/Experiments:Receiver Crosstalk

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Chiba-U.gif

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Receiver Cross-talk

Design

Fig.　 Crosstalk
Table. LuxR family gene Data modified from M.RIVAS et.al. Biol Res 38: 283-297, (2005)
Fig. Comparison of the predicted Lux box. Data modified from A.Fekete et.al. Anal Bioanal Chem 387:455–467,(2007)

クオラムセンシングにおける、レシーバータンパクを変えてクロストークを起こさせる。
センダーを変えたときと同様に、他種生物由来のレシーバーでもAHLに応答することは知られている(1)(2)。
本来の組み合わせとは異なるAHLを受け取るレシーバーの応答時間は遅くなり、遺伝子発現が遅くなる。
異なる生物はそれぞれに異なるLuxRタイプのタンパク質を持ち、それぞれアシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLに応答する。生物種によって異なるAHLと、それに応答するLuxRタイプのタンパク質はTableに示すとおりである。 Pseudomonas aeruginosa由来のRhlR,LasRも3OC6HSLを受け取ることがわかっている。


また、LuxR protein familyはLux boxという特定の配列を持ったプロモーター下にある遺伝子の発現を活性化する。(Fig. ) Lux boxも生物種によって配列が異なるが、ほとんど変わらない配列を持っているために違った生物種のLuxR protein familyであっても、AHLが存在下で遺伝子発現を活性化すると考えられる。


Experiment

LuxR protein familyを変えてクロストークさせる実験を行った。

AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。

AHL ReceiverとしてLuxR protein familyを発現させるReceiver plasmidと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。

AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。

蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。

使った遺伝子回路は以下の通りある。

  • Sender
  • Transcriptional regulator
  • Reporter
    • AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
LuxI-sender Chiba.gif
  • LuxR

LuxR-p15A Chiba.gif

  • Plux-GFP[http://partsregistry.org/Part:BBa_J37032 (BBa_J37032)]

Plux-GFP-pMB1 Chiba.gif

  • RhlR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084004 (BBa_K084004)]

RhlR-p15A Chiba.gif

  • LasR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084005 (BBa_K084005)]

LasR-p15A Chiba.gif

  • CinR[http://partsregistry.org/Part:BBa_K084006 (BBa_K084006)]

CinR-p15A Chiba.gif

Method

  1. Transformed Sender into E.coli strains(BWΔFliC) and Receivers into E.coli strain(BWΔFliC).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37c&deg； 12h.
  3. Inoculated again at 37c&deg； upto about OD600=2.0
  4. Washed them.
  5. Mixed them (Sender:Receiver=1000μl:1000μl).
  6. Incubated at 30°C.
  7. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.



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Result & Discussion

Fig.Time Delay Test Sender:LuxI,Receiver:LuxR
Fig.Time Delay Test Sender:LuxI, Receiver:LasR
Fig.Time Delay Test Sender:LuxI, Receiver:RhlR


さまざまなLux protein familyを発現させ、GFPの蛍光強度を測定した結果が上のグラフ

LuxRを発現させたとき、GFPは多く発現していることが分かる(Fig.1)が、そのほかのLasR,RhlRを発現させた場合、ほとんど蛍光強度が上昇していない。(Fig.2,Fig.3) つまり、遺伝子発現が活性化されていることが確認できなかった。 クロストークさせると、発現量が大きく減少してしまうのでタイムラグを確認できるほど遺伝子が発現がGFPでは確認できなかった

本実験では、LuxR以外のR protein familyには分解タグである,LVA tagがついていた。 LuxI->LasR->PLas,LuxI->RhlR->PRhlは元来発現強度が弱いので[http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract (1)]、LVAの影響により、さらに発現が見えにくくなったと考えられる。

よってLasRとRhlRのLVAをとり、Sender:LuxI, Receiver:LuxR,LasR,RhlRのクロストーク評価を行う必要がある。


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Demo ~Receivers~

English:
日本語:
固体培地中にセンダー[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623],(Ptet-LuxI) を混ぜ、固体培地表面にレシーバーのコロニーをN.Cフィルターで移す。 センダーの作るAHLは培地中を移動し、表面のレシーバーがAHLを一定濃度感知すればGFPを発現 する。一種のセンダーに対し、様々な種類のレシーバーを用いることで時間差が生じることを確認する。

用いるレシーバーは・・・


・シグナル自体を分解するAiia を利用する

・レシーバーの遺伝子回路を含むプラスミドのコピーナンバーの変化

・レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れる 　　　　　


・確認の仕方
N.Cフィルターをはった個体培地を37°Cで培養し、時間(30min?)ごとにUVをあててGFPが見えるかチェックする。
香取

Results

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