Team:Chiba/Experiments:copy number

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Chiba-U.gif

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Copy number of Receiver Plasmid

Design

Receiver copy number chiba.jpg

In this section, we intended to make an time-delay by differing the luxR protein's amount per cell.(*1) AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた。 To do this, we used a different copy number plasmid of the Receivers. (*1)


レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた


*1：英語が壊滅的に変です。。

Experiment

oriがpMB1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15AのローコピーベクターにのせかえたBBa_T9002を使用した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

  • Sender
  • Receivers
**[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623 (AHL autoinucer)]

LuxI-sender Chiba.gif

    • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)] |

High-Copy-Receiver Chiba.gif

  • Low Copy Receiver

Low-Copy-Receiver Chiba.gif



これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。

Method

  1. Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-colE1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(JW1908).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
  3. Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
  4. Washed sender and receivers.
  5. Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
  6. Incubated at 30°C.
  7. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR　Thermo ELECTRON CORPORATION)

Result & Discussion

Fig.　 Time Delay Test


(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。

この理由は

  1. GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
  2. LuxRの合成量が少なすぎる。

が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-colE1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-colE1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Data is not shown) このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。 したがって理由1が有力である。




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