Team:Chiba/jk/γ/Trl

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実験ログ
出力班


Contents

Time Responce Liquid

purpose

インダクションをかけてからいち早く、確認できる出力を見つけること
To find the earliest output gene after induction

Reporter

  • Fluorescent Protein
  • GFP
  • pGFPuv
BBa_T9002
  • Venus YFP
  • BBa_K084003
  • pLac-Venus YFP
  • mCherry

pLac-mCherry

  • β-gal (X-gal assay)

pUC19(plac-LacZα)


Equipment

shaking incubator
Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)
46-well plate(deep well)
96-well plate(deep well)
Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
Beckman Allegratm X-12R Centrifuga(Beckman Coulter)

Method

Fig. レポーターのタイムレスポンスの実験方法

Strain:XL10G KanR

  • Liquid medium experiment
  1. Pre-culture
    1. Picked and cultured the following plate in 2mL of LB:
      1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
      2. LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
    2. Cultured at 37°C for 12h.
  2. Culture
    1. Dilute pre-cultures and add to new LB medium.
      1. LB-Amp+0.2 % Glucose, (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
      2. LB-Amp, ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
    2. Cultured at 37°C for about 6 h
  3. Wash
    1. Transfer 10mL each of the culture to 50mL centrifuge tubes.
    2. Centrifuged for 6min at 3600rpm,20°C and discarded the supernatant.
    3. Add physiological saline and resuspention
    4. Repeated wash twice.
    5. Add M9 minimal medium.
  4. Mix
    1. Dispens each culture into 48-well deep well or 96-well deep well
    2. Add IPTG fainal conc. 0.2 mM (pGFPuv, pLac-Venus YFP, pLac-mCherry, pUC19)
    3. Add AHL fainal conc. 100nM ([http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002], [http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 BBa_K084003])
  5. Measure fluorescence intensity every 1 h.

Result

Discussion

このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である

  • X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間より遅い
  • X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる

以上の2つの理由から蛍光タンパク質が適している

またGFP,YFPの発現時間までのタイムラグが一番少なかった

  • 目視で確認した際、GFPのほうがYFPよりも目視で確認するのが容易であった

以上の理由から、出力はGFPとする。



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