Team:Chiba/Experiments:copy number

From 2008.igem.org

Copy number of Receiver Plasmid

Design

Fig. 1 Player Balancing

In this section, we intended to make an time-delay by differing the luxR protein's amount per cell.(*1) AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた。 To do this, we used a different copy number plasmid of the Receivers. (*1)

レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた

*1：英語が壊滅的に変です。。

Experiment

oriがpMB1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15AのローコピーベクターにのせかえたBBa_T9002を使用した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。

Method

1. Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-pMB1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(JW1908).
2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
3. Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
4. Washed sender and receivers.
5. Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
6. Incubated at 30°C.
7. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR　Thermo ELECTRON CORPORATION)

Result & Discussion

Fig.3.2 Time Delay Test: Highcopy Receiver & Reporter vs.Lowcopy Receiver & Reporter

(Ptet-LuxR-plux-GFP-pMB1)の発現量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。(Fig.3.2)

この理由は

1. GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
2. LuxRの合成量が少なすぎる。

が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-pMB1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-pMB1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Fig.3.3) このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。 したがって理由1が有力である。

Fig.3.3 Time Delay Test: Lowcopy Receiver & Highcopy Reporter vs.Highcopy Receiver-Reporter

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