Team:Chiba/Study

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Contents

難代謝性分子

リプレッサーとして今上がっているのが以下のとおり。

これら以外にもどのような難代謝性分子やレギュレーター、そして分子の生産方法についても調べていきます。


  • DmpR : (methyl)phenol
  • PcaR : p-hydroxy benzoate
  • CatR : cis,cis-macomater
  • PrmR : n-alkane
  • XylR : nitrotoluene
Toluene
  • AreR : Benzyl alkanoate
  • BenR : Bezoate
  • SalR : Salicylate Esters



  • 調べたこと
  • phnolの溶解度8.3 g/100 ml(20℃)[http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol [1]]
  • tyrosineからphenolを合成する反応[http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?rn:R00728 [R00728]]
  • tyrosineからphenolを合成する酵素：TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)[http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?enzyme+4.1.99.2 EC 4.1.99.2 ]
  • TPL(Tyrosine Phenol-Lyase)の原典
  • Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Purification Crystallization,and Properties :Biol.Chem.,245,No.7,1767-1772,1970
TPL(Escherichia intermedia A-21由来)の特性について.以下の項目について説明があります。
  • stability
  • stoichiometry
  • sedimentation coefficient(20℃,water)= 7.77
  • diffusion coefficient(20℃,water)=4.42×10-7cm2/sec
  • Michaelis constant = 2.31×10-4 M　(基質はL-tyrosine)
  • inhibitor(L-alanine) Ki=6.53×10-3 M
  • inhibitor(phenol) Ki=3.56×10-5 M
･･･他
  • Kumagai, H.,and H. Hideki.Tyrosine Phenol Lyase Coefector Requirements:Biol.Chem.,245,No.7,1773-1777,1970
TPLはピリドキサルリン酸(PLPA)がないと不活性である。また、最大活性を示すには、K+およびNH4+が必要。Na+により不活性化。など、TPLの機構についての説明があります。
  • Nick J. P. Wierckx,* Hendrik Ballerstedt, Jan A. M. de Bont, and Jan Wery.Engineering of Solvent-Tolerant Pseudomonas putide S12 for Bioproduction of Phenol from Glucose:Appl. Environ. Microbiol.,71,No.12,8221-8227,2005
グルコースからチロシン経由でpseudomonas putide S１２で２５時間後にフェノールを１．５ｍＭ生成。オクタノールの媒質二相で100時間後にフェノールを５８ｍＭ生成
  • tyrosine biosynthesis pathway [http://www.kegg.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=ppu&mapno=00400 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis - Pseudomonas putida KT2440]
＊論文とは違う株です。
  • Milic Dalibor; Matkovic-Calogovic Dubravka; Demidkina Tatyana V; Kulikova Vitalia V; Sinitzina Nina I; Antson Alfred A.Structures of apo- and holo-tyrosine phenol-lyase reveal a　catalytically critical closed conformation and suggest a mechanism for activation by K+ ions.Biochemistry,45,7544-7552,2006
TPLの触媒作用に重要なコンホメーションについて、およびフェノール生成反応のメカニズムについての記述があります。、
  • Gibson, J.M.,P. S. Thomas, J. D.Thomas, J. L. Baker, S. S. Chandran, M. K. Harrup, K. M. Draths, and J. W. Frost.Benzene-Free Synthesis of Phenol.Angew.Chem.Int.Engle.40,1945-1948
フェノールをシキミ酸から合成。


企画のための予備知識調べ

①バイオブリックパーツを挙げる ：福富、杉山

Sender signal Chiba-signalling.png

  • BBa_F1610(available,works)

3OC6HSL Sender device

LuxIを発現→3OC6HSLをつくります。[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_F1610 BBa_F1610のregistry]


他に-butyryl-HSL,3OC14HSLを出すパーツもありますが、実際に働くかはわかりません。

また、構造が似ているため混信してしまう可能性あり。 [http://partsregistry.org/Acyl-HSLs　　 AHL構造]

Siganl receiver Chiba-signalling.png

  • BBa_F2620(available,works)

Input:3OC6HSL Output:Pops

（利用法：ＧＦＰ合成[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_T9002　 BBa_T9002])

RBSChiba-rbs.png

RBSの翻訳速度？に違いがあるパーツがある模様…？
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_B0034 BBa_B0034] 基準
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_B0030 BBa_B0030] (strong) efficiency 0.6
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0032 BBa_B0032] (medium) efficiency 0.3
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0031 BBa_B0031] (weak) efficiency 0.07
  • [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:BBa_B0033 BBa_B0033] (weaker) efficiency 0.01

PromoterChiba-promoter.png

  • LacI regulated(induced by IPTG)
[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0011　　 BBa_R0011](pl hybrid)
[http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_R0010 BBa_R0010]


②入力の追従性を高めるためには？ ：冨永、香取

  • GFPのfolding時間について

'superfast' GFPという変異体のfolding時間は、1000秒ちょっと(in vitro)だ、というデータが載ってました。また、folding時間が短いのに加えて、unfoldしにくく、GFPとしての機能をほとんど損なわないものでもあるそうです。(Fisher AC, DeLisa MP (2008) Laboratory Evolution of Fast-Folding Green Fluorescent Protein Using Secretory Pathway Quality Control. PLoS ONE 3(6): e2351. doi:10.1371/journal.pone.0002351)

  • ルシフェリンをエネルギー源としてGFPを光らせる、「生物発光共鳴エネルギー移動（BRET、 Bioluminescence Resonance Energy Transfer）」という現象の利用(自ら光る蛍光タンパク質による高精度細胞イメージング技術の開発より)

ルシフェラーゼ濃度とルシフェリンの発光強度の関係には、両対数で直線になるものもある（promega:Renilla luciferase assay systemより）。ルシフェラーゼをGFPに結合させるので、foldingに時間がかかりすぎてしまう。


  • 大腸菌による青色色素の合成(PATENT)

ＤＣＳ生産性放線菌(S. lavendulae)に特異的に存在する遺伝子：bpsA (blue-pigment synthetase A)を、大腸菌に導入することによって（４'－ホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子を挿入した発現ベクター（例えば、pSTV/svp）を同時に導入し、共発現させる必要あり）、青色色素（indigoidine）を合成させることができる。生成速度、分解速度は調査中。

③（入力に対して）リニアなプロモーターにはどんなのがある？ ：小林、久保

・2007東工大作成のハイブリットプロモーター。（ひとつはlac repressorで制御され、もう一方はAHLで活性化されます。） [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_I751101 BBa_I751101]

・アラビノースプロモーター

（・AHL、luxRの種類の選択により、pluxの発現強度とAHL濃度にリニアな関係が得られる。）


④読み出し可能な出力って？ ：川崎、井山

出力の種類として大まかに8つの項目でわけてみました。


  • ①蛍光タンパク質
パーツとしてすでに多く存在。閾値を見るのになら向いてるかも・・・
色素と比べ必要な遺伝子が少ない。複雑になる回路に向いてそうです。


  • ②色素
・・・カロテノイドなど色素を発生させるには一つの遺伝子ではできない。

生体由来の色素

  • カロチノイド
カロチン・キサントフィル・クリプトキサンチン
  • フラボノイド
フラボン類・フラバノン・アントクロール・アントシアン・カテキン
  • キノン類の色素
メラニン
  • ポルフィリン系色素
クロロフィル・チトクロム ・フェオホルビド・フェオポルフィリン・ヘムエリトリン・
ヘモグロビン・ヘモバナジン・ヘモシアニン・ポルフィリン・ポルフィン・ミオグロビン
  • フィコビリン系色素
フィコシアニン・フィコビリン・フィコエリスリン・フィトクロム
  • アリザリン
  • アントシアン
  • アントラキノン
  • インジゴ
  • ウロビリン
  • エリトロクルオリン
  • カルタミン
  • キサントマチン
  • クルクミン
  • クロセチン
  • クロリン
  • クロロクルオリン
  • クロロフィリド
  • ゲニステイン
  • コチニール
  • ゴッシポール
  • コンメリニン
  • シコニン
  • ステルコピリン
  • ゼアキサンチン
  • タンニン
  • ツラシン
  • バクテリオクロロフィル
  • ビキシン
  • ビリベルジン
  • ビリルビン
  • ヒペリシン
  • ピンナグロビン
  • フコサンチン
  • ブラジリン
  • プルプリン
  • ベタシアニン
  • ベルベリン
  • ホルビリン
  • マンゴスチン (mangostin)
  • モリンジン
  • ラミナラン
  • レグヘモグロビン
  • リコピン
  • リトマス
  • ルテイン
  • ロドプシン
  • ロドキサンチン
  • ロドマチン


  • ③走化性
誘引物質の刺激がないときは、CheAが活性化されていて、細胞内にある応答調節因子である CheYのアスパラギン酸残基をリン酸化し、
リン酸化したCheYがべん毛モーターの右回転（方向転換）を起こす。つまり、細胞は方向転換してその場を離れようとする。
逆に誘引物質が受容体に結合すると、CheAは不活性のままで、リン酸化型CheYの濃度が下がり、べん毛モーターは左回転（直進）する。
一定時間直進し、方向転換してはまた直進を繰り返す大腸菌だが、誘引物質の濃度が高い方へ進んでいるときは直進する頻度が増加する。
また一定の刺激が続くと受容体が応答しにくくなるという性質により、刺激物質濃度の時間変化を検出できる。


  • ④増殖系
増えます。


  • ⑤匂い系
大腸菌の代謝経路中で合成されるのはテルペン類（植物中に多く含まれ、総数は２２０００以上）、
（[http://ja.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%9E%E3%83%A1%E3%83%90%E3%83%AD%E3%83%B3%E9%85%B8%E7%B5%8C%E8%B7%AF 非メバロン酸経路]）で作られるらしいです。
過去のigemでは[http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Edinburgh/Yoghurt エディンバラ０７]がにおいを使ってました。


  • ⑦シグナル系
ホモセリンラクトン
・・・約pH７で半減期は1000分。培地が塩基性になるとAHLのラクトン環が加水分解される。
  • ⑧人工物質系
人工物質を大腸菌に作らせることができるらしい。
この機能が使えるなら、『消えない分子』の問題が解消するはず。詳細は調査中。


リプレッサー候補として、今のところ以下のようなものが挙げられています。

＊DmpR : (methyl)phenol

＊PcaR : p-hydroxy benzoate

＊CatR : cis,cis-macomater

＊PrmR : n-alkane

＊XylR : nitrotoluene

Toluene

＊AreR : Benzyl alkanoate

＊BenR : Bezoate

＊SalR : Salicylate Esters

勉強会

今までの勉強会についての簡単なログです。

6/28/08 メール勉強会

  • 色素について

6/26/08 第6回勉強会

5/30/08 Wiki講習会

5/03/08 第7回事例研究

5/02/08 第6回事例研究

5/01/08 第5回事例研究

4/28/08 第4回事例研究

4/25/08 第5回勉強会&第3回事例研究

4/22/08 第2回事例研究

4/18/08 第1回事例研究

4/17/08 第4回iGEM勉強会

4/14/08 第3回iGEM勉強会

4/11/08　第2回iGEM勉強会

4/09/08　第1回iGEM勉強会

  • 「iGEMとはなにか？」
  • プレ事前研究


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