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Contents

2008.9.1

・Ptet+RBS+cIの、Mini Prep産物の濃度チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-の機能チェック。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-,-PcI-GFP-p15A-Cm-をDouble Transformation(BWΔflic)
結果→GFPが発現していた。
→-PcI-GFP-p15A-Cm-が機能していないのでは?
→ターミネーターをつける、pSB1A3にのせかえる。
-Ptet-cI-pMB1-Amp-のDigestion Check


混ぜ表

DoubleSingle
dH2O 12
XbaI 11
SpeI 1-
BSA(×10) 11
NEB(×10) 11
DNA 55
TOTAL 1010


UV照射テスト
・-Ptrc-LuxR-Plux-cI-colE1-Amp-,-PcI-GFP-p15a-Cm-の2plasmid(BW)
・グリストをつついて2ml培養(UV⊕用と、UV⊖用の2本)
・37℃,12h後UV測定(UV⊕:5.21,UV⊖:5.38)
・小さなプレートにLB培地ごと流してUV照射開始。(UVは254nm,UVまでの距離は7.5cm,UV⊖のものは暗所に置いておく。)
・乾かないようにポリエチレン製サランラップで蓋をした。
・UV⊕はUV照射後0min,10min,30min,1h,2h,4h,6h,8に、UV⊖は0h,1h,4h,8hによく攪拌してから、20μl採取。それぞれを
・10^4,10^5希釈し、20μlをプレートに撒いた。
・37℃,12h後にコロニーを数える。


コロニー数

UV+ 104UV+ 105UV-104UV-105
0min 42374271156
10min 30151--
30min 1397--
1h 895104054
2h 51--
4h 2025450
6h 00--
8h 101155106

2008.9.2

UV照射実験
・Ptet,Ptet-RFP,PrecA-RFPのグリストをつついて2ml培養(LB-Amp)
・37℃,12h後,ODを測定して102~103のコロニーができるようにプレートに撒く。Ptet×1(コントロール用),Ptet-RFP×1(コントロール用),Prec-RFP×3(コントロール用×1,UV照射用×2)
・新たなAmpプレート8枚(2.5cm,6.5cmのそれぞれ30sec,1min,30min,1h用)に、撒いて37℃,12hたったコントロール用のPtet,Ptet-RFPのコロニーをニトロセルロースでうつしてはる。
・PrecA-RFPのプレートにUVを照射する。UVからの距離は2.5cmと,6.5cmの2パターンで実験する。Prec-RFPのコントロール用は暗所に置いておく。
・UV照射後30sec,1min,30min,1h経過したらそれぞれ(2.5cmでUV当てたもの、6.5cmでUV当てたもの、コントロール用)のプレートからニトロセルロースでコロニーをうつしとり、あらかじめコントロールをはっておいたAmpプレートにはりつけた。
・それぞれのプレートでUVが照射されてからどのくらいの時間でRFPが発現するのかを調べるためにUV照射してから、0min,10min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h後にスキャナーで取り込んで色の変化を見る。

結果
PrecA-RFPにUVを当てたものはいづれもRFPが目で確認できなかった。

2008.9.12

Pbad/araCのL-アラビノースによるスイッチングテスト
I1304(Ptet-RBS-GFP,XL10G)×1(①)(ネガティブコントロール用),R0051(PcI)×4(②~⑤)のコロニーをつついて2ml培養。
37℃,12h後液が濁っていたら、ODをはかり、48穴deep wellに①~⑤の菌液をそれぞれ190μl入れた。
L-アラビノースを以下のような濃度になるように入れた。


混ぜ表

20%L-アラビノース濃度
-N.C
1.9μl0.2%
19μl2%
190μl20%
-P.C


L-アラビノースを入れてから15min,1h,2h,6h,12h,24h後に蛍光強度を計測した。
結果は以下のとおり。


L-アラビノース入れて30分後 8.8909.75210.109.4139.701
L-アラビノース入れて1h後 9.16113.9317.3714.9710.60
L-アラビノース入れて2h後 9.41727.9640.2529.8710.72
L-アラビノース入れて6h後 9.93374.99150.9125.010.04
L-アラビノース入れて12h後 10.6499.39202.8872.0811.76
L-アラビノース入れて24h後 14.66105.6447.333.3117.11

2008.9.13

Time Delay Test
①T9002(Ptet) -p15a-Kan(BW)
②Plac-RhlI -Amp(BW)
③Plac-LasI -Amp(BW)
④Ptet-LuxI -Amp(BW)


プレ培
①LB-Kan 2ml培養
②、③LB-Amp -0.2%グルコース 2ml培養
④LB-Amp 2ml培養
↓over night
<本培>
50ml遠心管に①の菌液100μlとLB-Kanを20mlを加える。
50ml遠心管に②、③それぞれの菌液10μlとLB-Amp 0.2%グルコースをそれぞれに6mlを加える。
50ml遠心管に④のLB-Ampを6mlを加える。
OD>2となったらWash


↓冷却遠心(3700rpm,3min)          
上澄みを捨てる
LB-Kanを20ml加える。            


②、③、④
↓冷却遠心(3700rpm,3min)
上澄みを捨てる。
LBを2ml加える。            
↓冷却遠心(3700rpm,3min)
上澄みを捨てる。
LBを2ml加える。
↓冷却遠心(3700rom,3min)
上澄み捨てる。
LB-Ampを6ml加える。