Team:Chiba/protocol/phenotype/timedelay/j

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Contents

Time-delay check

目的 Purpose

To Confirm that communication using non-endogenous molecules results in slower activation of receivers.

装置 and 試薬 Equipments　and Materials

  • 装置 Equipment
    • shaking incubator(37°C,30°C)
    • 46-well plate(deep well)
    • Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
  • 試薬 Materials
    • AHL(100uM)
    • E.coli Culture Containing T9002
    • E.coli Culture Containing plasmids you will testing

プロトコル Protocol [1]

プレ培（O/N,測定日の前日）,Culturing overnight (before the testing day):

  • グリセロールストックからpickして、37℃しんとう培養器で一晩培養する(LB-Amp液体培地,2mL,37°C )。
  1. Inoculate all cultures you will testing from gloycerol stocks into 2mL of LB-ampicillin liquid medium.
  2. Also inoculate a culture containing T9002 into 2mL of LB-ampicillin liquid medium.
  3. Incubate all cultures with shaking at 37°C(O/N).

翌日,Following day

  • T9002
  1. 培養液100μLを、40mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
  2. Wash(T9002)-->培養液を50mlファルコンチューブに、10mlずつ分注。
-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
  1. 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
  2. 48　deep well plateに、1mlずつ分注。


  • others
  1. 培養液12.5μLを、5mlのLB-Amp液体培地に加え、37℃で6-8時間しんとう培養する。
  2. Wash-->3500rpmで6分間遠心。上澄みを捨てる。
-->新しいLB-Amp培地を3mlずつ加え、pipettingにより再懸濁。

-->この操作を二回繰り返す

  1. 新しいLB-Amp培地を10mlずつ加え（1倍希釈）、pipettingにより再懸濁。
  2. 48　deep well plateに、所定量分注。
  • 測定
  1. 96 shallow well plateに100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
  2. 37°Cでしんとう培養
  1. 2h後、3h後…に、100μLずつ分注し、蛍光強度を測定する。
  • 測定条件
測定前-->shake:On time = 1min,Off time = 10 sec,
測定-->integration time = 1000ms
Beam width:Normal Beam
Wavelength pair = 485nm(excitation) and 527nm(emission)

issues? discussion

蛍光強度がいくつ以上なら目視で確認できるのか-->閾値

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