Team:Chiba/Project

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Chiba-U.gif

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Abstract

Fig.1 Project desgin
"Team : Chiba - E.coli time manager"

　　We control the timing of gene expression by using multiple signaling devices.To this end,we utilize molecules associated with Quorum sensing, a phenomenon that allows bacteria to communicate with each other.Our project uses two classes of bacteria: senders and receivers. Senders produce signaling molecules, and Receivers are activated only after a particular concentration of this molecule is reached.Although different quorum sensing species have slightly different signaling molecules, these molecules are not completely specific to their hosts and cross-species reactivity is observed [http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract (1)],[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity (2)]. Communication using non-endogenous molecules is less sensitive, and requires a higher signal concentration to take effect.This results in slower activation of receivers.

Introduction

Fig.2 Team logo








Our project

Fig. Our system

従来:消えていく物質の存在時間によって時間調節する。Missouri Miners 2007 "A biological timer"

千葉:常に物質が一定の割合で蓄積されるとき、ある閾値超えるまでの時間調節する。

調節する方法には、二つが挙げられる。

  • 蓄積するときの割合を変える。
  • 閾値自体を変える。
  • 右の絵は一定の割合で水がある容器の中にたまっていく様子を示している。
  • ここでは、容器に水がたまることった時が閾値を超えた時とする
  • 一番上は蓄積するスピードが速く、容器が小さいのでたまる時間は短い
  • 真ん中は蓄積するスピードは速いが、容器が大きいためにたまる時間は遅くなる
  • 一番下は蓄積するスピードが遅く、容器が大きいためにたまる時間がより遅くなる



System design

Fig.Project design

Our project uses two classes of bacteria: senders and receivers.Senders produce　signaling molecules, and　receivers are activated only after a particular concentration of this　molecule is reached.The communication using non-endogenous molecules is less sensitive,and it requires higher signal concentration to take effect.This results in slower activation of receivers.

About Quorum Sensing

　　Quorum sensing is a cell-to-cell signaling action of bacteria. Species of Gram-Negative signaling transfer molecules (so-called autoinducer) is a series of acyl homoserine lactone (AHL). The signals are synthesized by a synthase protein(LuxI-type　proteins) and once they have reached a threshold　concentration,they bound to a transcriptional regulatory　protein(LuxR-type proteins) to induce expression of target genes.

More about Quorum Sensing

  • [http://parts.mit.edu/registry/index.php/Featured_Parts:Cell-Cell-Signaling Cell-Cell-Signaling]
  • [http://www.che.caltech.edu/groups/fha/quorum.html About Quorum sensing]

Controlling the time of a cell-to-cell signaling action

Communication using non-endogenous molecules is less sensitive, and requires a higher signal concentration to take effect.This results in slower activation of receivers.

シグナル分子に対する応答速度を変えるためには３つの方法が考えられる。

  1. シグナル分子を作るSenderを変える
  2. シグナルを受け取るReceiverを変える
  3. シグナル分子自体を分解して、邪魔をする

Signal Molecule Sender

Sender switch Chiba.jpg
Fig.4 AHL varieties

　English:Each species has their own LuxI-type proteins,which synthesize their specific autoinducers,AHLs.AHLs produced by different LuxI-type proteins differ only in the length of the acyl-chain moiety and substitution at position C-3.LuxR,which is original for Vibrio fischeri,is activated by its cognate autoinducer,3OC6HSL.However,LuxR is also activated by non-endogenous molecules,C4HSL,C6HSL,and 3OC12HSL.Activation by non-endogenous molecules requires a higher signal concentration[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity (2)].This results in slower activation of receivers,when AHL concentration is increasing.


AHLsおよびその合成酵素

Strain AHL LuxI-type protein
P.aeruginosa C4HSL RhlI
V. fisheri 3OC6HSL LuxI
P.aeruginosa 3OC12HSL LasI


日本語:異なる生物はそれぞれに異なるLuxIタイプのタンパク質を持ち、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。それぞれの生物種のLuxIタイプのタンパク質、それが合成する分子名は以下の表のようである。 (Fig.4).AHLを受け取り応答するLuxRタンパク質はVibrio fischeri由来であり、3OC6HSLに応答する。しかし、他種生物由来のAHLにも応答することが知られており、このとき、より高い濃度のAHLが必要となる[http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity (2)].AHLがゆっくり溜まっていく時、LuxRは3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。 (冨永)

Sender experiments details

Signal Molecule Receiver

Chiba project design Receiver.jpg

English:

日本語:AHLを合成するSenderだけではなく、AHLを受け取る側のReceiverを変えれば、その応答時間を変えることができる。そこで私たちは、以下のいくつかの方法を考えた。

  1. 一種類のSender（AHL<--LuxI）に対して、由来生物の異なるレシーバタンパク質でそれを受信する.
  2. レシーバータンパク質であるLuxRに変異を入れることで、AHLに対する応答感度を上下させること.
  3. レシーバーのコピーナンバーを変える.

（福冨、小林）


Quorum-Sensing Cross-talk

Receiver switch chiba.jpg

English:

日本語::異なる生物はそれぞれに異なるLuxRタイプのタンパク質を持ち、それぞれアシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLに応答する。生物種によって異なるAHLと、それに応答するLuxRタイプのタンパク質は以下の表のよう。 Pseudomonas aeruginosa由来のRhlR,LasRも3OC6HSLを受け取ることがわかっており、このとき、より高い濃度の3OC6HSLが必要となる().3OC6HSLがゆっくり溜まっていく時、LuxRが最も早く応答し、RhlR、LasRはそれよりも遅く応答する。

Strain AHL LuxR-type protein
P.aeruginosa C4HSL RhlI
V. fisheri 3OC6HSL LuxI
P.aeruginosa 3OC12HSL LasI

(冨永)





Copy number of Receiver Plasmid

Receiver copy number chiba.jpg

レシーバーのコピーナンバーを減らすことで、thresholdに達するまでの時間を短縮する。

LuxR/Plux mutants show

Receiver switch mLuxR chiba.jpg

私たちはmutated Receiverを用いることで、AHL感受性の違う２種類（WTと変異体）のレシーバーを用意し、delay-timeのバリエーションを増やした。

  1. a greater response to 3OC6HSL[http://authors.library.caltech.edu/5553/ (3)]
  2. a increase in sensitivity to 3OC12HSL[http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/151/11/3589 (4)].


Receiver experiments details

Signal Molecule Quencher

Chiba project design.jpg

AiiAによるAHL分解を同時に起こすことで、AHL供給速度を遅くする.

  • AHL reporter with aiiA
Express LuxR and aiiA constantly. AiiA degrades AHL as signaling molecule. Express GFP when the AHL concentration exceed the capacity of aiiA.
This enables the delay of the activation time of receiver.


AiiA experiments detail


Demo Experiments

実験内容とdataかるく

Demo experiments detail

English: 日本語:

Conclusion

けつろん

Future Work

references

  1. [http://www3.interscience.wiley.com/journal/119124142/abstract M.K Winson et al.:Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors　for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing.FEMS Microbiology Letters 163 (1998) 185-192]
  2. [http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity BBa_F2620:Specificity]
  3. [http://authors.library.caltech.edu/5553/ C. H. Collins.et al.:Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones.Mol.Microbiol.2005.55(3).712–723]
  4. [http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/151/11/3589 B. Koch. et al.:The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and inhibitors.Microbiology 151 (2005),3589-3602]
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