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Team:Chiba/Reporter
From 2008.igem.org
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Reporter
レスポンスの早いレポーターを選ぶことが目的
- Luciferase
- 蛍光たんぱく
- β-gal (X-gal assay)
Experiment
大腸菌:XL10G
- 蛍光たんぱく
- GFP
- pGFPuv
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
- Venus YFP
- [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K084003 BBa_K084003]
- pLac-Venus YFP-
- mCherry
- pLac-mCherry
- β-gal (X-gal assay)
- PUC19(plac-LacZ)
- 装置 Equipment
- shaking incubator(37°C,30°C)
- Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)
- 46-well plate(deep well)
- 96-well plate(deep well)
- Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
- Beckman Allegratm X-12R Centrifuga(Beckman Coulter)
- 固体編
固体培地(pLacであれば0.2%グルコース入り)にまく
コロニーを新しい固体培地(pLacであればIPTG, ptetであればAHL, LacZならばIPTGとX-gal）にコロニーリフトする＝スタート
37°Cのしんとう培養器で培養
30分ごとに目視で確認できるか観察
- 液体編
プレ培
コロニーを固体培地からピックし、LB培養液2ml（pLacであれば0.2%グルコース入り）で12時間培養(37°C)
本培
OD値を計測して、菌数を合わせるため培養液を1/200に希釈する。
OD=1.00くらいになるまで37°Cで培養
生理食塩水で洗浄(2.0min 8,000rpm)x2
46穴または96穴deep wellにM9(2ml)で培養
IPTG(最終濃度0.1mM),AHL(最終濃度100nM)を加えて、計測開始
30分ごとに蛍光強度、OD値を計測、また目視で確認できるか観察
Result
Conclusion
このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である
分解されやすいLuciferineやX-galを基質とするLuciferaseやβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまう
そのため、基質のいらない蛍光タンパク質が適している。
基質も合成するLuxCDABEを発現させると、レスポンスが早くなる可能性がある。
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