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Team:Chiba/Reporter
From 2008.igem.org
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Reporter
本プロジェクトではある一定時間がたった時に、遺伝子発現が起こるといったタイマーを作ることが目的
時間がたった時を出力する段階でタイムラグができるだけ少なくなるように、遺伝子発現から確認までに時間のかからない出力が必要
そこで候補となったのは、以下の3種類
- 蛍光たんぱく
- 化学発光(luciferase)
- 染色 (LacZ and X-gal assay)
実験に使用したのは、蛍光たんぱくとβ-gal(lacZ)を評価した
蛍光たんぱくとしてはGFPと、maturationの早いVenus YFP[http://www.nature.com/nbt/journal/v20/n1/full/nbt0102-87.html|(1)]を選んだ。
Luciferaseは化学発光であるために、発現の確認には暗所でなければならないため使用条件が限られてしまうために候補から外した
Experiment
大腸菌:XL10G
- 蛍光たんぱく
- GFP
- pGFPuv
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002]
- Venus YFP
- [http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K084003 BBa_K084003]
- pLac-Venus YFP-
- mCherry
- pLac-mCherry
- β-gal (X-gal assay)
- PUC19(plac-LacZ)
- 装置 Equipment
- shaking incubator(37°C,30°C)
- Innova 4200 Benchtop or Floor-Stackable Incubator Shaker(37°C)
- 46-well plate(deep well)
- 96-well plate(deep well)
- Fluoroskan Ascent 2.5(program:Ascent Software Version 2.6)
- Beckman Allegratm X-12R Centrifuga(Beckman Coulter)
- 固体編
固体培地(pLacであれば0.2%グルコース入り)にまく
コロニーを新しい固体培地(pLacであればIPTG, ptetであればAHL, LacZならばIPTGとX-gal）にコロニーリフトする＝スタート
37°Cのしんとう培養器で培養
30分ごとに目視で確認できるか観察
- 液体編
プレ培
コロニーを固体培地からピックし、LB培養液2ml（pLacであれば0.2%グルコース入り）で12時間培養(37°C)
本培
OD値を計測して、菌数を合わせるため培養液を1/200に希釈する。
OD=1.00くらいになるまで37°Cで培養
生理食塩水で洗浄(2.0min 8,000rpm)x2
46穴または96穴deep wellにM9(2ml)で培養
IPTG(最終濃度0.1mM),AHL(最終濃度100nM)を加えて、計測開始
30分ごとに蛍光強度、OD値を計測、また目視で確認できるか観察
Result & discussion
- LacZはX-galの濃度によって目視での確認時間が変わった
- X-galの濃度を変えて計測
- 液体、固体似たような結果になった（目視での確認時間）
このプロジェクトでは、発現するまでの時間を変えることが目的である
以下の2つの理由から蛍光タンパク質が適している
- X-galの濃度を高くすると発現を確認できるまでの時間は短くなったが、蛍光たんぱくで発現を確認できるまでの時間とほとんど変わらない
- X-galを基質とするβ-galでは、時間がたつごとに基質濃度が下がり、出力までの時間が長くなってしまうことも考えられる
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