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Team:Chiba/AiiA Receiver Phase
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Revision as of 12:34, 29 October 2008
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AiiA Receiver
Fig. AiiA Receiver
Design
オートインデューサー不活性化酵素であるAiiAをレシーバー菌で発現させることにより、レシーバー菌内でのAHL濃度の増加が遅くなるため、AiiAを発現しないレシーバー菌に比べて、GFP発現が遅くなる。（小林）
Fig. AiiA Reaction
Experiment
ReceiverでAiiAを共発現させて遺伝子発現を確かめる実験を行った。
AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。
AHL Receiverとしてと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。
AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。
蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。
使った遺伝子回路は以下の通りある。
- Sender
- [http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623 (AHL autoinucer)]
- Receivers
- AiiA Receiver
- non-AiiA Receiver
Method
- Transformed Sender into E.coli strains(BWΔFliC) and Receivers into E.coli strain(BWΔFliC).
- Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37c°； 12h.
- Inoculated again at 37c°； upto about OD600=2.0
- Washed them.
- Mixed them (Sender:Receiver=1000μl:1000μl).
- Incubated at 30°C.
- Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.
result
Fig.Time Delay Test
24時間後の蛍光強度を比較すると最大強度は1/4に下がっている。
transfer curveがシグモイドではなく、時間に比例するようになった
AiiAを発現させると、GFPの発現自体が極端に減ってしまったので、AHL自体を減らしてしまうと発現量の最大値が小さくなってしまう。
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