Team:Chiba/AiiA Receiver Phase

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Chiba-U.gif

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AiiA Receiver

Fig. AiiA Receiver


Design

オートインデューサー不活性化酵素であるAiiAをレシーバー菌で発現させることにより、レシーバー菌内でのAHL濃度の増加が遅くなるため、AiiAを発現しないレシーバー菌に比べて、GFP発現が遅くなる。（小林）


Fig. AiiA Reaction


Experiment

ReceiverでAiiAを共発現させて遺伝子発現を確かめる実験を行った。

AHL senderとしてVibrio fischeri由来のLuxIを常に発現させ、3OC6HSLを合成させる。

AHL Receiverとしてと,Lux promoter下にGFPを含むレポータープラスミドをダブルトランスフォーメーションさせた。

AHL senderによって合成されたAHLをAHL receiverが受取り、Lux promoter下のGFPが発現する。

蛍光強度を蛍光リーダーを使ってGFPの発現を計測し、遺伝子発現の活性を調べた。

使った遺伝子回路は以下の通りある。

  • Sender
    • [http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 BBa_S03623 (AHL autoinucer)]

LuxI-sender Chiba.gif


  • Receivers
    • AiiA Receiver

AiiA-Receiver-genetic-circu Chiba.gif

    • non-AiiA Receiver

Non-AiiA-Receiver Chiba.gif

Method

  1. Transformed Sender into E.coli strains(BWΔFliC) and Receivers into E.coli strain(BWΔFliC).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37c&deg； 12h.
  3. Inoculated again at 37c&deg； upto about OD600=2.0
  4. Washed them.
  5. Mixed them (Sender:Receiver=1000μl:1000μl).
  6. Incubated at 30°C.
  7. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.


Result & Discussion

Fig.Time Delay Test

24時間後の蛍光強度を比較すると最大強度は1/4に下がっている。

transfer curveがシグモイドではなく、時間に比例するようになった

AiiAを発現させると、GFPの発現自体が大幅に減ってしまったので、AHL自体を減らしてしまうと発現量の最大値が小さくなってしまうことがわかった。

AHLが低濃度のときだけでAiiAを発現するような遺伝子回路であれば、タイムレスポンスができると考えられる


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