Team:Chiba/Experiments:copy number

From 2008.igem.org

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===Experiment===
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*High Copy Receiver[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (AHL Reporter)]
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oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。
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[[Image:T9002.copy-number-change Chiba.gif]]
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*Medium Copy Receiver
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これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。
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以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。
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===='''Sender'''====
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*AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
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[[Image:LuxI-sender Chiba.gif|left|]]<br clear=all>
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===='''Receiver'''====
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*[http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)]
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[[Image:High-Copy-Receiver Chiba.gif]]<br clear=all>
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*Low Copy Receiver
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[[Image:Low-Copy-Receiver Chiba.gif]]
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これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。
===Result & Discussion===
===Result & Discussion===

Revision as of 20:09, 29 October 2008

Chiba-U.gif


Copy number of Receiver Plasmid

Design

Receiver copy number chiba.jpg

レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた

Experiment

oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

Sender

  • AHL autoinucer[http://partsregistry.org/Part:BBa_S03623 (BBa_S03623) ]
LuxI-sender Chiba.gif

Receiver

  • [http://partsregistry.org/Part:BBa_T9002 BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)]

High-Copy-Receiver Chiba.gif

  • Low Copy Receiver

Low-Copy-Receiver Chiba.gif

これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。

Result & Discussion

more about Plasmid Copy number

Fig. Time Delay Test


  • クオラムセンシングに関わる遺伝子のベクタープラスミドのコピーナンバーを少なくすることで、遺伝子発現が遅くなる
  • それと同時に、遺伝子発現の最大値自体も少なくなってしまう

more about experimental result




Method

  1. Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-colE1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(BD⊿FliC).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
  3. Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
  4. Washed sender and receivers.
  5. Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
  6. Incubated at 30°C.
  7. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL&Fluoroskan AscentR Thermo ELECTRON CORPORATION)