Team:Chiba/Experiments:copy number

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これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。
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#Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-colE1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(BD⊿FliC).
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#Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
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#Incubated at 30°C.
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#Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR　Thermo ELECTRON CORPORATION)
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===Result & Discussion===
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(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。
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*クオラムセンシングに関わる遺伝子のベクタープラスミドのコピーナンバーを少なくすることで、遺伝子発現が遅くなる
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*それと同時に、遺伝子発現の最大値自体も少なくなってしまう
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この理由は
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#GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
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#LuxRの合成量が少なすぎる。
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が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-colE1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-colE1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Data is not shown)
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このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。
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したがって理由1が有力である。
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（小林）
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[[Team:Chiba/AHL Receiver Phase#Plasmid_Copy_number|more about experimental result]]
 
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Revision as of 20:12, 29 October 2008

Chiba-U.gif

Home The Team The Project Parts Submitted to the Registry Reference Notebook Acknowledgements


Copy number of Receiver Plasmid

Design

Receiver copy number chiba.jpg

レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた

Experiment

oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

Sender

LuxI-sender Chiba.gif

Receiver

High-Copy-Receiver Chiba.gif

  • Low Copy Receiver

Low-Copy-Receiver Chiba.gif

これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。

Method

  1. Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-colE1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(BD⊿FliC).
  2. Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
  3. Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
  4. Washed sender and receivers.
  5. Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
  6. Incubated at 30°C.
  7. Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR　Thermo ELECTRON CORPORATION)


Result & Discussion

Fig.　 Time Delay Test

(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。

この理由は

  1. GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
  2. LuxRの合成量が少なすぎる。

が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-colE1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-colE1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Data is not shown) このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。 したがって理由1が有力である。 （小林）



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