Team:Chiba/Experiments:copy number

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Revision as of 20:13, 29 October 2008

Copy number of Receiver Plasmid

Design

レシーバーのコピーナンバーを変えることで、応答までの時間を変える
コピーナンバーを変えれば、レシーバーによるLuxRの合成量は変化する
AHLを受け取るLuxRが変わるので応答閾値までの時間が変わると考えた

Experiment

oriがcolE1のハイコピーベクターにのったBBa_T9002と、oriがP15Aのローコピーベクターに乗ったT9002バリエーションを使用した。

これらを比較することでコピーナンバーを変えることでの影響を調べた。

以下の遺伝子回路を使って、実験を行った。

Sender

AHL autoinucer(BBa_S03623)

Receiver

BBa_T9002 (Express GFP in response to AHL)

Low Copy Receiver

これらのほかにBBa_T9002にはChloramphenicol耐性マーカーを持つ空ベクター、Low copyバリエーションにはAmpicillin耐性マーカーの空ベクターをダブルトランスフォーメーションさせた。

Method

Transformed sender(Ptet-LuxI), high copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-colE1) and Medium copy receiver(Ptet-LuxR-Plux-GFP-p15A) respectively into E coli strains(BD⊿FliC).
Inoculated them independently in liquid media. Incubated at 37°C 12h.
Inoculated again in Fresh liquid media upto about OD600=2 at 37°C
Washed sender and receivers.
Mixed them. (Sender:Receiver=1000μL:1000μL)
Incubated at 30°C.
Measured intensity of green fluorescence at regular time intervals.(Fluoroskan AscentR FL＆Fluoroskan AscentR　Thermo ELECTRON CORPORATION)

Result & Discussion

(Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。

この理由は

GFPがローコピーのベクターに乗っていたので発現量が落ちた。
LuxRの合成量が少なすぎる。

が考えられるが、(Ptet-luxR-p15A + plux-GFP-colE1)と(Ptet-LuxR-pLux-GFP-colE1)ではまったく同じTrasnfor Carveの軌跡を描いた。(Data is not shown) このことより、p15Aのベクターに乗ったLuxRの発現量は、ハイコピーのベクターに乗ったpLuxを活性化するのに十分な量であると考えられる。したがって理由1が有力である。（小林）

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 ===Result & Discussion===
-[[Image:Copy-nomber-change-result-detail version Chiba.gif|thumb|left|'''Fig.　''' Time Delay Test]]
+[[Image:Copy-nomber-change-result-detail version Chiba.gif|flame|left|'''Fig.　''' Time Delay Test]]
+<br clear=all>
 (Ptet-LuxR-plux-GFP-colE1)の発言量に比べて(Ptet-LuxR-pLux-GFP-p15A)の発現量は大きく減少してしまった。